多效唑對芋種質離體保存影響的初步研究

董偉清，閉志強，唐軍，江文，高美萍，周維，陳麗娟，蔡炳華

（廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院生物技術研究所，南寧，530007）

多效唑對芋種質離體保存影響的初步研究

董偉清，閉志強，唐軍，江文，高美萍，周維，陳麗娟，蔡炳華

（廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院生物技術研究所，南寧，530007）

以荔浦芋無菌試管苗為材料，研究了試管苗保存過程中不同濃度多效唑（PP333）對試管苗保存效果的影響。研究結果表明，多效唑對芋種質資源的離體保存有顯著影響，在光照時間14～16 h/d，光照強度1 500 lx，室溫（26± 2）℃的培養(yǎng)條件下，在MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L＋30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中添加0.6 mg/L PP333，試管苗可保存240 d，存活率為89.7%，且恢復生長后試管苗形態(tài)正常、長勢良好，與對照株無明顯差異。

芋；離體保存；生長恢復；多效唑

芋（Colocasia esculentaL.Schott），又名芋艿、芋頭，其球莖富含淀粉、維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分，是世界各地廣為栽培的蔬菜和糧食作物[1]，也是可選的生物能源作物。廣西是我國芋主產區(qū)之一，擁有眾多馳名中外的優(yōu)良品種，如廣西荔浦縣的荔浦芋和梧州紅芽芋是主要的出口芋產品。由于芋為無性繁殖作物，長期反復種植造成許多優(yōu)良品種種性退化、品質變劣,種植面積日益減少，甚至瀕臨絕種；一些野生芋種質資源也因環(huán)境的改變和人為因素的破壞而逐漸消失。因此，作為廣西特色農作物，芋的種質資源保存利用研究已迫在眉睫。對無性繁殖的蔬菜種質資源而言，因為不能以種子形式進行低溫保存，所以離體保存技術是理想的保存途徑之一[2]。本文通過在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的多效唑（PP333），研究其對芋離體保存的影響，并對長期保存的材料進行生長恢復，為芋種質資源中長期保存體系的建立提供可選的技術方法。

1 材料與方法

1.1 無菌材料的制備

以優(yōu)良荔浦芋品種桂芋一號為試材，切取飽滿的頂芽或側芽，用自來水沖洗20 min，晾干，70%乙醇表面消毒30 s，浸入0.1%升汞溶液消毒10 min，無菌水沖洗4次，在超凈工作臺上剝取莖尖生長點接種于啟動培養(yǎng)基MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L＋30 g/L蔗糖中。1周后，外植體開始膨大，隨后長出葉片，待芽長到1.5～2.0 cm時，轉接到增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L＋30 g/L蔗糖中擴繁。

1.2 離體保存與生長恢復

選用生長勢一致的試管幼苗，以MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L＋30 g/L蔗糖為基本培養(yǎng)基，分別添加生長抑制劑多效唑（PP333）0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/L。培養(yǎng)條件：光照時間14～16 h/d，光照強度1 500 lx，室溫（26±2）℃。每處理隨機選取10瓶，每瓶3株，定期觀察記載其生長情況和存活率。材料保存一定時間后取出，在室溫和光照條件下恢復生長30 d后，轉接到繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上，調查保存材料的生物學性狀。

2 結果與分析

2.1 多效唑（PP333）濃度對芋試管苗存活率的影響

將芋離體保存在添加不同濃度多效唑的MS培養(yǎng)基上，定期檢查其存活率，并與對照（CK）作比較，從表1可以看出，附加生長抑制劑PP333，可提高芋試管苗的存活率。短期內（60 d）各處理存活率均能達到100%。保存 120 d后，PP333濃度在 0.4～ 0.8 mg/L范圍時，芋種質存活率提高，為82.0%～ 94.6%，均高于對照。保存180 d后，PP333各濃度處理都能提高芋種質的存活率，濃度在0.6～0.8 mg/L范圍的存活率與保存120 d的效果相當，但PP333濃度為1.0～1.2 mg/L時，存活率明顯下降。保存240 d后，對照組植株枯萎死亡，僅存少量。PP333濃度為0.4 mg/L時，在180 d時的存活率（74.2%）明顯高于PP333濃度為 1.0～1.2 mg/L的存活率 （49.0%～ 52.2%），但240 d后，其存活率迅速下降到23.6%，遠低于濃度為 1.0～1.2 mg/L的存活率 （42.0%～ 51.4%）。結果顯示，不同的保存時間，不同濃度的PP333處理離體芋種質的存活率不盡相同，其中MS培養(yǎng)基中含0.6 mg/L PP333的處理，芋離體種質的存活率最高，240 d后仍可達到89.7%。培養(yǎng)基中不添加PP333或濃度過低、過高都不利于芽的試管保存。

2.2 不同濃度多效唑（PP333）對試管苗長勢的影響

從試管苗的株高變化來看（表2），隨著PP333添加濃度的提高，芋離體植株株高逐漸降低，說明PP333能有效抑制植株的伸長生長。保存30 d時，PP333抑制株高的效果并不十分明顯，隨著時間的延長，抑制作用逐漸加強，180 d后，對照組生根明顯，無分蘗，葉片枯萎。其中控制植株高度（5.5 cm）較合適的PP333濃度為0.4 mg/L，但該濃度下試管苗的存活率不如處理2、3的高（表l）。此外，隨PP333濃度的提高，植株變得粗壯，葉色濃綠，PP333濃度為1.2 mg/L時，葉片增厚，變脆。當保存120、180、240 d時，均是濃度為0.6 mg/L的效果最為理想。

表1 不同濃度多效唑（PP333）對芋試管苗存活率的影響

表2 不同濃度多效唑（PP333）對芋試管苗株高的影響

表3 離體保存恢復后的試管苗性狀

2.3 不同濃度多效唑（PP333）對保存芋試管苗恢復培養(yǎng)的影響

將連續(xù)保存240 d存活下來的芋試管苗轉接至繼代及生根培養(yǎng)基上恢復生長，每間隔20 d繼代一次，連續(xù)繼代3次，結果見表3。離體保存的芋試管苗經繼代恢復后，長勢旺盛，平均株高和叢生芽倍數略低于正常水平，葉片形態(tài)正常，長度和寬度變化不大，顏色翠綠；生根情況正常，根系發(fā)達，單株根數3～4條，15 d后根長至3～4 cm，白皙粗壯。保存后恢復的試管苗生物學性狀與保存前試管苗無明顯差異，尚未見變異植株與其他不良影響。

3 討論與結論

建立在組織培養(yǎng)基礎上的緩慢生長離體保存是在保證植物種質遺傳完整性的前提下減緩試管苗的生長，減少繼代次數，達到中、長期保存植物種質資源的目的[3]。通過添加生長延緩劑或生長抑制劑，可抑制保存材料的生長，延緩其繼代周期。常用的生長調節(jié)物質有脫落酸（ABA）、矮壯素（CCC）、多效唑（PP333）、丁酰肼（B9）、馬來酰肼（MH）等[4]。 目前，在草莓[5]、蘋果[6]、菠蘿[7]、柑橘[8]、姜[9]、菊花[10]、紅根草[11]上均有關于多效唑延長種質保存時間的研究報道，而對芋種質離體保存研究十分缺乏，僅宋明等[12]、畢可華[1]對芋的保存作了研究探討。

本文應用多效唑（PP333）作為生長抑制劑，通過0.4～1.2 mg/L濃度試驗，將芋試管苗保存240 d后恢復培養(yǎng)，結果表明，在光照時間14～16 h/d，光照強度1 500 lx，室溫（26±2）℃的培養(yǎng)條件下，PP333的使用可以減緩材料的生長速度，有效延緩繼代時間，顯著提高芋試管苗常溫保存的成活率。綜合芋試管苗存活率、株高、離體保存恢復后的試管苗性狀各因素，以PP3330.6 mg/L的使用濃度取得的保存效果較佳。在離體保存過程中，隨PP333濃度的提高，芋試管苗形態(tài)特征發(fā)生變化，如植株變得粗壯，葉色濃綠，PP333濃度為1.2 mg/L時，葉片增厚，變脆。但進行恢復培養(yǎng)后，試管苗恢復正常，可能是植物對逆境刺激所產生的適應性變化。本試驗僅初步探討了PP333對芋離體保存的影響，下一步需要綜合利用多種因素，如低溫、多種生長抑制劑共同作用等，研究芋種質的離體保存，在保證植物種質遺傳完整性的前提下，更大限度地延長芋試管苗離體保存時間。

[1]畢可華.芋試管苗離體培養(yǎng)與保存技術研究[J].北方園藝，1998（2）：9-10.

[2]王海平，李錫香，沈鏑，等.離體保存技術在無性繁殖蔬菜種質資源保存中的應用[J].植物遺傳資源學報，2010，11（1）：52－56.

[3]王艷芳.菊花緩慢生長離體保存研究[D].南京：南京農業(yè)大學，2007.

[4]周遜，向長萍.植物生長調節(jié)劑在種質離體保存中的研究進展[J].長江蔬菜，2009（6）：6-7.

[5]趙密珍，刁曼妮，錢亞明，等.多效唑對草莓種質離體保存的影響[J].植物遺傳資源學報，2003，4（3）：242-244.

[6]王桂蘭，陳超，李玉華.延長蘋果試管苗保存時間的研究[J].河北林果研究，2002，9（3）：239-241.

[7]呂玲玲，徐雪榮，孫德權，等.菠蘿種質的離體保存研究[J].西北植物學報，2007，27（4）：834-838.

[8]權銀，陳竹生，郭天池，等.柑橘種質的離體保存[J].中國南方果樹，1996，25（4）：3-5.

[9]韋坤華，李林軒，繆劍華，等.姜種質資源離體保存技術研究[J].北方園藝，2013（8）：112-116.

[10]蘭偉，陳發(fā)棣.紀伊潮菊離體保存及其遺傳穩(wěn)定性分析[J].西北植物學報，2010，30（3）：487-494.

[11]付傳明，趙志國，黃寧珍，等.藥用植物紅根草種質資源的離體保存[J].廣西植物，2007，27（4）：653-657.

[12]宋明，王曉佳，陳世儒.芋頭試管芽的保存研究[J].西南農業(yè)大學學報，1991，13（4）：409-412.

Effects of Paclobutrazol on Conservation of Taro(Colocasia esculentaL.Schott) Germplasm Resourcesin Vitro

DONG Weiqing,BI Zhiqiang,TANG Jun,JIANG Wen,GAO Meiping, ZHOU Wei,CHEN Lijuan,CAI Binghua
(Biotechnology Research institute,Guangxi Academy of Agriculture Sciences,Nanning 530007)

In this research,we studied the conservation effects of paclobutrazol with different concentrations on taro (Colocasia esculentaL.Schott)seedlingsin vitro.The results showed that,paclobutrazol affected thein vitroconservation of taro germplasm resources significantly,and the best culture medium was MS+2.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA＋30 g/L sucrose+0.6 mg/L PP333,which could conserve plantlets for 240 days with the survival rate of 89.7%,under the cultural condition with illumination time of 14-16 hours per day,illumination intensity of 1 500 lx and room temperature of(26±2)℃. Furthermore,the recovered plantlets grew well and showed no difference in morphology with those of control treatment.

Taro(Colocasia esculentaL.Schott);In vitroconservation;Growth recovery;Paclobutrazol

S632.1；S482.8+.92

A

1001-3547（2013）24-0037-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.24.013

國家科技支撐計劃子課題（2012BAD27B01-6），廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項-重點項目（桂農科2013YZ02），廣西壯族自治區(qū)南寧市青秀區(qū)科學研究與技術開發(fā)計劃項目（2013N08）

董偉清（1981－），女，碩士，助理研究員，主要從事植物生物技術研究工作，電話：18677099255，E-mail：529516161@qq.com

閉志強，通信作者，高級實驗師，主要從事作物遺傳育種研究工作，電話：0771-3244185，E-mail：zhiqiangbi@163.com

2013-11-08