一例種鴨病毒性腸炎與圓環病毒混合感染的實驗室診斷

朱衛華 趙亭 趙萬升 李靜 范明杰 張莉莉 李玉峰

中圖分類號：S858.314.4+3? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）11-0051-03

鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE）又稱鴨瘟，是雁形目鴨科成員的一種急性、接觸性、敗血性傳染病，主要侵害宿主的消化道、內臟和淋巴器官，造成消化道出血、淋巴器官受損和實質性器官的退行性病變。該病呈世界分布，在我國主要養鴨地區廣泛存在，但主要呈地方性流行。該病的病原是鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus， DEV），現歸于皰疹病毒科馬立克氏病毒屬。該病毒可以感染各品種和日齡的鴨，發病率和死亡率最高可達100%，是對鴨致病性最強的病原之一，一旦感染往往會對鴨群造成嚴重損失。黃引賢等[1]最早于1959年報道了該病在我國的存在，之后我國研發出了針對該病的弱毒疫苗，起到了較好的防控效果。

鴨圓環病毒（Duck circovirus，DCoV）感染最早報道于德國[2]，據稱能夠引起鴨生長遲滯，發育不良，并造成鴨免疫抑制增加其他病原繼發感染的可能。DCoV呈世界性分布，流行病學調查發現其在養鴨業中的陽性率較高。DCoV可以感染北京鴨、番鴨等多個品種，根據其基因組結構可以分成I型和II型[3]，目前在我國主要養鴨地區流行毒株以I型為主。

近來某養殖公司陸續出現育成期種鴨發生DVE的病例，發病時間多在10～16周齡，發病鴨群表現精神不振，采食量下降，排白色或綠色稀糞，死亡率達到每天1%～3%，經實驗室診斷為DEV與DCoV混合感染，現報道如下：

1? 材料與方法

1.1? 病料采集與處理? 發病鴨來自山東地區某種鴨場15周齡育成鴨，外觀精神萎靡，有的表現頭頸腫大。剖檢可見心肌出血或心肌蒼白，肝臟腫大出血，脾臟斑駁狀或者出血，有的胰腺壞死;腸道有明顯的腸炎癥狀，泄殖腔出血明顯。多數病死鴨食道有典型的條紋狀出血或壞死。采集病死鴨肝臟、脾臟和胰腺等作為病料，混合后以1：5比例加入滅菌生理鹽水，使用組織勻漿機將病料打碎形成混懸液，置-80℃凍融2次，4℃ 8000g離心15min，取上清進行實驗室PCR檢測。

1.2? 實驗室PCR診斷? 病料上清按照試劑盒（Axyen）方法提取病毒核酸，利用本實驗室設計的針對禽流感病毒（AIV）、鴨腸炎病毒（DEV）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨呼腸孤病毒（DReoV）、鴨細小病毒（DPV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）和鴨圓環病毒（DCoV）等常見病原的引物，通過PCR或RT-PCR方法進行病毒核酸檢測。

1.3? 病毒分離? 病料上清加入適量抗生素（卡那霉素1000IU/mL），混合后通過絨毛尿囊膜途徑接種12日齡健康鴨胚，每胚0.1mL。接種后每天觀察鴨胚死亡情況，收集死亡鴨胚絨尿膜和尿囊液，按照以上方法進行實驗室PCR核酸檢測。

1.4? 動物回歸試驗? 將病毒分離物以生理鹽水1：100稀釋，通過肌肉注射途徑接種5只10日齡健康雛鴨，每只接種0.2mL，另設5只作為對照，肌肉注射生理鹽水0.2mL/只，每天觀察記錄試驗鴨發病和死亡情況。采集死亡試驗鴨肝臟、脾臟等病料進行實驗室病毒核酸檢測。

2? 結果

2.1? 實驗室PCR檢測? 病毒核酸檢測結果顯示，DEV和DCoV-I型為陽性，其他常見病毒均為陰性。結果見圖1。

2.2? 病毒分離? 病料接種鴨胚于接種后72～96h死亡，死亡鴨胚表現絨尿膜水腫，胚體出血。分離病毒核酸檢測結果為DVE陽性，其他病毒均為陰性，結果見圖2。

2.3? 動物回歸試驗? 攻毒組試驗鴨于攻毒后96h開始發病，表現精神沉郁，食欲廢絕，于144h全部死亡，剖檢可見肝臟壞死出血，食道條紋狀出血等典型病毒性腸炎癥狀，5只試驗鴨病料實驗室檢測均為DEV陽性，結果見圖3。

綜合實驗室PCR檢測、病毒分離和動物回歸試驗結果，將該病例判定為鴨病毒性腸炎與圓環病毒混合感染。

3? 討論

DVE是養鴨生產中的傳統疫病，一般呈地方流行或散發，但該病近年來有發病增加趨勢。根據從業者反映，現有的弱毒疫苗對該病的保護率有所下降，鴨群發生病毒性腸炎后用弱毒疫苗緊急免疫效果不理想，有的養殖場發病后將緊急免疫劑量提高到十倍以上仍不奏效。自2006年以來，國內多次出現“新型鴨瘟”疫情的報道[4， 5]，該疫情的流行特點、發病癥狀等均與傳統病毒性腸炎相似，病原也具有皰疹病毒的特征，但中和試驗證明其與DEV不同。近年來的病例實驗室診斷結果病原仍是DEV，弱毒疫苗也具有一定的保護效果，說明這些病例不是“新型鴨瘟”。報道顯示，這些流行毒株與疫苗株和原參考株僅有個別基因差異，從分子水平來看沒有發生明顯變異[6， 7]。

在本病例中，除DEV以外還檢測到DCoV-I型病毒。DCoV自發現以來，世界上多個國家報道了該病原的存在，我國的福建、浙江、廣東、廣西、山東、安徽、河南等主要養鴨地區均有該病報道，流行病學調查顯示以上主要省份DCoV感染總陽性率在30%左右，而個別鴨場陽性率可達80%以上[8]。感染DCoV病鴨表現為生長遲緩、體況消瘦、羽毛發育障礙等癥狀，病理學分析表明DCoV可以造成法氏囊、胸腺、脾臟、肝臟等器官損傷，尤其是引起淋巴細胞凋亡而造成免疫抑制，從而加劇其他病原的致病性[9]。由于DCoV感染普遍存在，近來DVE病例經常能夠同時檢測到DCoV，因此推測這可能是DVE免疫失敗的原因之一。但是，由于缺乏實驗證據，DEV和DCoV是否能夠協同致病以及其協同致病機理仍需進一步研究。

DCoV目前尚無有效的分離培養方法，也沒有商品化的疫苗產品可供使用（因此在病毒分離時，僅分離到DEV）。對于該病的防控只能采取嚴格的生物安全手段，避免使用劣質的粗制抗體以防止該病的人為傳播。另外，還應該關注該病在父母代及祖代種鴨上的感染情況，必要時采取有效的凈化措施，切斷病毒的垂直傳播途徑。

參考文獻：

[1]? 黃引賢，歐守杼，鄺榮祿，等. 鴨瘟病毒的研究 [J]. 華南農學院學報， 1980， （01）： 21-36.

[2]? Hattermann K.， Schmitt C.， Soike D.， Mankertz A. Cloning and sequencing of Duck circovirus （DuCV） [J]. Archives of virology， 2003， 148（12）： 2471-2480.

[3]? 萬春和，程龍飛，傅光華，等.鴨圓環病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鑒別診斷方法的建立[J].中國家禽， 2016， 38（17）： 53-55.

[4]? 刁有祥，呂桂霞，鄭福英，等.一種新型鴨瘟病原的分離鑒定及其特性[J].中國獸醫學報， 2006， （02）： 136-139.

[5]? 丁巧玲，袁生，李建軍，等.廣東部分地區發生“新型鴨瘟”的初步診斷報告[J].廣東畜牧獸醫科技，2006，（04）： 28+32.

[6]? 傅光華，陳翠騰，劉榮昌，等.鴨瘟病毒新近分離毒株部分基因變異分析[J].畜牧獸醫學報，2018，49（10）：2215-2222.

[7]? 姜甜甜， 張大丙. 鴨瘟強毒與疫苗毒的囊膜糖蛋白序列比較 [J]. 中國獸醫雜志， 2013， 49（02）： 3-7.

[8]? 黃瑜，萬春和，彭春香，等.鴨圓環病毒感染的臨床癥狀 [J].中國家禽， 2013， 35（05）： 47-48.

[9]? 李鵬飛.鴨圓環病毒在人工感染雛鴨體內的侵染分布、組織病理學觀察及其致凋亡作用的研究[D].雅安： 四川農業大學， 2015.