微生物全基因組范圍內的最小基因組研究進展

劉曉艷，閔勇，張薇，王開梅，萬中義，江愛兵，張光陽，程賢亮，楊自文

（1.國家生物農藥工程技術研究中心，湖北省生物農藥工程研究中心，湖北省農業科學院，武漢，430064；2.湖北生物科技職業學院）

微生物全基因組范圍內的最小基因組研究進展

劉曉艷1，閔勇1，張薇2，王開梅1，萬中義1，江愛兵1，張光陽1，程賢亮1，楊自文1

（1.國家生物農藥工程技術研究中心，湖北省生物農藥工程研究中心，湖北省農業科學院，武漢，430064；2.湖北生物科技職業學院）

最小基因組是當前合成生物學研究的熱點，從全基因組代謝網絡研究入手，介紹了最小基因組研究的必要性和技術方法，并對其在工業微生物分子育種中的應用進行分析，綜合闡述了最小基因組研究的發展前景。

微生物；全基因組；最小基因組；分子育種

1 基因組代謝網絡

如今，伴隨著高通量測序技術的應用和費用的降低，全基因組測序技術也越來越受歡迎。通過基因組測序，對基因進行功能注釋，把基因編碼蛋白所催化的生化反應稱為一個代謝網絡，通過計算機轉化為數學模型，再用試驗數據加以驗證，提出假設，能夠對生物體以及生物現象作出預測，是合成生物學研究中的一個重要的研究手段[1]。

2 研究最小基因組的必要性

最小基因組是指在最合適的條件下維持細胞生長繁殖所必需的最少基因[2]，優勢小基因組菌株是指含有特殊功能基因/簇的最小基因組菌株。通過對菌株基因組的減縮，可以達到如下目的：①可以提高菌株的代謝效率、降低代謝冗余；②基因組越小，微生物生長速度越快；③增加目標產物合成量，消除副產物[3～5]，解決目前發酵產業中存在的發酵過程有副產物、底物轉化率偏低、生長周期過長、增效因子產量較低和菌株不穩定等問題。

3 最小基因組研究內容和手段

3.1 菌株全基因組測序

截止到2011年7月1日，據Genomes Online Database數據庫報道：6 891株微生物完成全基因組測序，其中包含細菌2 780株、真核微生物121株、古菌107株、病毒2 697株、質粒1 186個。越來越多的微生物開始進行全基因組測序[6～13]。

3.2 必需基因的確定

必需基因的確定主要有3種方法：

①利用生物信息學預測必需基因[14～17]第一步，利用在線數據庫（Database of Essential Genes，DEG，http://tubic.tju.edu.cn/deg/）進行分析。將目標菌株的全基因組序列和數據庫中同類菌株的基因組數據進行對比，如果遺傳相似性大于50%，則可能為必需基因。

第二步，利用在線分析軟件（http://tubic.tju.edu. cn/GC-Profile/）分析基因組島。分析結果將全基因組分成N+1個區域，N+1個區域的 （G+C）%值與全基因組的（G+C）%值進行比對，相差較大的可能是基因組島，即可能通過水平轉移獲得的基因，可以刪除。

第三步，利用在線分析軟件（http://tubic.tju.edu. cn/Ori-Finder/）分析復制原點，確定oriC的位置和大小，復制原點側翼序列需要保留。

②確立菌株核心編碼區，確定必需基因 通過選擇同源關系較遠的同屬菌株全基因組序列，確定保守核心編碼區。

③通過計算機構建模型 將代謝途徑與數學符號進行對應，從而構建出全基因組代謝模型[18]。

4 微生物最小基因組縮小常用的技術手段

對微生物基因組進行定點無痕修飾是目前基因組縮小常用的技術手段，主要包括：①傳統同源重組；②利用λ-Red系統的同源重組；③利用Cre/ loxP切除系統和Tn轉座系統[19～22]。

4.1 大腸桿菌基因組的縮短

大腸桿菌是生物領域被研究得最透徹的模型生物之一，其代謝網絡也被研究得很清楚，因此被用于科研領域、醫藥研究、發酵工業等，生產重組蛋白、氨基酸或者其他化學品。2001年，Mizoguchi等[23]利用2個連續的λ-Red介導的同源重組（圖1）對Escherichia coliK12菌株進行了基因組刪除，突變株MGF-01蘇氨酸的合成能力是野生株的2倍。

圖1 大腸桿菌大片段敲除技術的原理示意[23]

圖2 枯草芽孢桿菌大片段敲除技術的原理示意[24]

圖3 鏈霉菌大片段敲除技術的原理示意[26]

4.2 枯草芽孢桿菌基因組的縮短

枯草芽孢桿菌是一種在土壤中廣泛存在的革蘭氏陽性菌，同蘇云金芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌歸類于日蠟樣芽孢桿菌群。因為該菌可以產生很多具有良好生物活性的次級代謝物，所以被研究得很廣泛。Takuya等[24]2008年通過RecA介導的同源重組（圖 2）對枯草芽孢桿菌的基因組進行了縮短， 得到了一系列突變株。 突變株MGB874由于缺少0.87 Mb的基因組序列，表現出良好的特性，該突變株MGB874發酵液中的纖維素酶和蛋白酶活性均比野生型細孢高出約1.7倍和2.5倍，同時還能延長蛋白酶的生產期。

4.3 鏈霉菌基因組的縮短

鏈霉菌是一種應用較廣的工業微生物，能夠合成較豐富的次級代謝產物，如抗生素和一些有應用價值的化合物[25]。Murakami等[26]2007年利用CreloxP的位點特異性重組對鏈霉菌的基因組進行了縮短，獲得了一系列的突變體（圖 3）。當使用的培養基為鏈霉菌合成阿佛菌素的最佳培養基時，鏈霉素和頭孢霉素C在突變體菌株中的產量均高于原宿主菌的產量。

5 小結

目前優勢小基因組研究是合成生物學領域研究的熱點。通過基因組縮小研究，能夠構建一個“小且單純”的宿主，來維持外源基因的穩定性，以便于大規模培養。這樣的優勢宿主在重組蛋白表達、基因治療或疫苗載體的制備，以及藥用化合物和大宗化學品的制備等方面具有重要應用價值和前景。

[1]房柯池，王晶.全基因組范圍代謝網絡的構建和最小基因組研究[J].生命科學，2011，23（9）：853-859.

[2]張柳燕，常素華，王晶．從首個合成細胞看合成生物學的現狀與發展[J]．科學通報，2010，55（36）：3 477-3 488.

[3]王媛媛，郭文斌，宋存江.工業微生物菌種改造的新方法——優勢小基因組生產菌的構建[J].微生物學報，2012，52（3）：286-294.

[4]Koonin E V．How many genes can make a cell:The minimal gene set concept[J]．Annual Review of Genomics and Human Genetics,2000(1):99-116.

[5]方宏清，陳惠鵬．大腸桿菌基因組減小研究進展[J]．生物技術通訊，2009，20（4）：564-567.

[6]宋存江.合成生物學技術在功能發酵制品生產菌種改造中的應用[C]//2012年第五屆全國微生物遺傳學學術研討會論文摘要集.北京：中國知網，2012：11-12.

[7]Cello J,Paul A V,Wimmer E.Chemical synthesis of poliovirus cDNA:Generation of infectious virus in the absence of natural tem-plate[J].Science,2002,297(5 583): 1 016-1 018.

[8]Smith H O,Hutchison C A,Pfannkoch C,et al.Generating a syntheticgenome by whole genome assembly:phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:15 440-15 445.

[9]Gibson D G,Benders G A,Andrews-Pfannkoch C,et al. Complete chemical synthesis,assembly,and cloning of a Mycoplasma genitalium genome[J].Science,2008,319 (5 867):1 215-1 220．

[10]Pósfai G,Plunkett G,Fehér T,et al.Emergent properties of reduced-genomeEscherichia coli[J].Science,2006, 312(5 776):1 044-1 046．

[11]Hashimoto M,Ichimura T,Mizoguchi H,et al.Cell size and nucleoid organization of engineeredEscherichia coli cells with a reduced genome[J].Molecular Microbiology, 2005,55(1):137-149．

[12]Mizoguchi H,Mori H,Fujio T.Escherichia coliminimum genome factory[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2007,46:157-167．

[13]Geng W,Cao M,Song C,et al.Complete genome sequence ofBacillus amyloliquefaciens LL3,which exhibits glutamic acid-independent production of polyγ-glutamic acid[J].Journal of Bacteriology,2011,193 (13):3 393-3 394.

[14]Mushegian A R,Koonin E V.A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes[J].Proceedings of the National Academy of Science of the United states of America,1996,93:10 268-10 273.

[15]Koonin E V.Comparative genomics,minimal gene-sets

and the last universal common ancestor[J].Natural Reviews Microbiology,2003(1):127-136．

[16]Gao F,Zhang C T.Ori-Finder:A web-based system for findingoriCsin unannotated bacterial genomes[J].BMC Bioinformatics,2008(9):79-84.

[17]Gao F,Zhang C T.GC-Profile:a web-based tool for visualizing and analyzing the variation of GC content in genomic sequences[J].Nucleic Acids Research,2006,34: 686-691．

[18]陳琦，王卓，魏冬青．代謝網絡流分析進展及應用[J]．科學通報，2010，55（14）：1 302-1 309．

[19]Fehér T,Papp B,Pal C,et al.Systematic genome reductions:Theoretical and experimental approaches[J].Chemical Reviews,2007,107:3 498-3 513．

[20]Zhang L,Chang S,Wang J.How to make a minimal genome for synthetic minimal cell[J].Protein and Cell, 2010(1):427-434．

[21]Baba T,Ara T,Hasegawa M,et al.Construction ofEscherichia coliK-12 in-frame,single-gene knockout mutants:The Keio collection[J].Molecular System Biology, 2006(2):1-5.

[22]Lee S Y.Systems biology and biotechnology ofEscherichia coli[M].Daejeon:Republic of Korea(South Korea), 2009:19-40．

[23]Mizoguchi H,Mori H,Fujio T.Escherichia coliminimum genome factory[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2007,46:157-167．

[24]Takuya M,Ryosuke K,Keiji E,et al.Enhanced recombinant protein productivity by genome reduction inBacillus subtilis[J].DNA Research,2008,15:73-81．

[25]Mamoru K,Takuma U,Satoshi O,et al.Genome-minimizedStreptomyceshost for the heterologous expression of secondary metabolism[J].Proceedings of the National A-cademy of Sciences,2009,107(6):2 646-2 651．

[26]Murakami K,Tao E,Ito Y,et al.Large scale deletions in theSaccharomyces cerevisiaegenome create strains with altered regulation of carbon metabolism[J].Applied Microbiology Biotechnology,2007,75:589-597．

Advances in Minimal Genome Research in Microbial Whole Genome

LIU Xiaoyan1,MIN Yong1,ZHANG Wei2,WANG Kaimei1,WAN Zhongyi1,JIANG Aibing1, ZHANG Guangyang1,CHENG Xianliang1,YANG Ziwen1
(1.National Biopesticide Engineering Research Center,Hubei Biopesticide Engineering Research Center, Hubei Academy of Agricultural Science,Wuhan 430064;2.Hubei Vocational College of Bio-technology)

Minimal genome has become the current research focus of synthetic biology.In this paper,we introduced the necessity and technical methods to carry out the research of minimal genome,and analyzed its application in industrial microbial molecular breeding,in addition,we discussed the development prospect of minimal genome research.

Microbe;Whole genome;Minimal genome;Molecular breeding

Q933；Q344+.13

A

1001-3547（2013）24-0009-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.24.003

劉曉艷（1979-），女，博士，副研究員，主要從事植物病理學及生物農藥分子生物學研究，電話：027-59101919，E-mail：xiaoyanliu6613@163.com

楊自文，通信作者，電話：027-59101919，E-mail：lky666888@126.com

2013-10-17