時間分辨熒光免疫分析法在乙型肝炎病毒表面抗原檢測中的應用

王雄

(陵水黎族自治縣婦幼保健院檢驗科，海南陵水572400)

時間分辨熒光免疫分析法在乙型肝炎病毒表面抗原檢測中的應用

王雄

(陵水黎族自治縣婦幼保健院檢驗科，海南陵水572400)

目的探討時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)定量檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的臨床應用價值。方法分別用TRFIA和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測237例血清樣本HBsAg，并在高、中、低三濃度中各取20例標本用兩種方法復檢，對比結果進行分析。結果在237例標本中，TRFIA測得陽性99例，ELISA陽性91例，陽性率差異無統計學意義(P＞0.05)；高、中濃度標本各20例均為陽性，檢出率差異無統計學意義(P＞0.05)，而低濃度標本中用TRFIA測得陽性20例，ELISA只有12例陽性，檢出率差異有統計意義(P＜0.01)。結論TRFIA較敏感，在低濃度HBsAg檢測中更具優勢，提高了臨床檢測水平，具有較高的實用價值。

時間分辨熒光免疫分析法；酶聯免疫吸附試驗；乙型肝炎表面抗原；定量檢測

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導致的一種在全球廣泛流行的傳染病，以HBV感染數和HBsAg攜帶率估算，全世界HBsAg攜帶者有3.5億人，其中亞、非、拉地區有2.8億，據中國流行病學調查，乙肝人群發生率較高，HBsAg攜帶率約為15%[1]，占全世界HBsAg攜帶者的1/3，而HBsAg的檢出是乙型肝炎的早期診斷之一，因此需要一種準確、靈敏、簡便的檢測方法。隨著科學技術的不斷發展，其檢測的方法越來越多，各具特點。國內分為定性和定量檢測，抗原定性實驗一般是用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，該法使用雙抗體夾心法，具有易操作、重復性好、試劑穩定等優點；定量分析則有各種化學發光法和放射免疫分析法，這些方法因儀器、試劑昂貴或使用放射性元素而無法普及應用。最新發展起來的采用非放射免疫標記技術的時間分辨熒光免疫測定分析法(TRFIA)，用鑭系元素標記抗原或抗體，同時利用時間和波長兩種技術有效排除干擾，具有酶標記、同位素標記技術的優點，且不受樣品的自然熒光干擾，靈敏度高、特異性強、重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、易于自動化和應用范圍廣泛等優點，近年來得到極大發展[2-3]。為了加強對乙型肝炎潛伏期的檢測，本文采用ELISA法與TRFIA法檢測237例標本血清，探討其在檢測HBsAg中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 標本來源隨機抽取來自本院門診健康體檢和孕產婦的乙肝測定血液標本237例，同時用TRFIA和ELISA分別作定量和定性測定，其中男性126例，女性111例，年齡10～70歲，平均(46.47±15.69)歲。

1.2 試劑ELISA法使用北京萬泰生物技術有限公司提供的乙肝病毒表面抗原診斷試劑盒，TRFIA法使用中山達安基因股份有限公司提供的乙肝病毒表面抗原定量檢測試劑盒。

1.3 儀器中山達安基因股份有限公司生產的DR-M6601時間分辨熒光免疫分析儀，芬蘭進口Thermo-MK3酶標儀等。

1.4 方法將分離到的標本血清分別用TRFIA法和ELISA法進行檢測。TRFIA法定量檢測乙型肝炎HBsAg的含量；ELISA法定性檢測HBsAg，結果判為陰性和陽性。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，同時加入相應的標準質控進行檢測。先用兩種方法檢測收集的標本血清HBsAg陰陽例數，當ELISA法測得S/COS＞1，TRFIA法＞0.5 ng/ml時，HBsAg結果為陽性；反之，結果為陰性。然后，將TRFIA法測得的HBsAg定量結果按＞225 ng/ml，5～225 ng/ml，＜5 ng/ml為標準分為高、中、低三個濃度，并各取20份再用兩種方法進行檢測。

1.5 統計學方法采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，數據用配對資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法測定237例臨床血清標本結果在237例標本中，TRFIA法測得結果陽性99例(42%)，ELISA法測得結果91例(38%)，兩種方法檢測結果陽性有91例，TRFIA法陽性而ELISA法陰性的有8例，利用配對資料的χ2檢驗，差異無統計意義(χ2=0.56，P＞0.05)，兩法檢測結果符合率為96.62%。

2.2 兩種方法檢測高、中、低三種濃度血清HBsAg結果的比較將上述HBsAg含量高濃度血清(TRFIA法檢測結果＞225 ng/mL)，HBsAg含量中等濃度血清(TRFIA法檢測結果在5～225 ng/ml之間)，HBsAg含量低濃度血清(TRFIA法檢測結果＜5 ng/ml)各取20例分別用兩種方法進行測定，結果見表2。可以發現，HBsAg含量高濃度和中濃度的血清用兩種方法均可檢測出來，符合率為100%，高濃度和中濃度的兩種檢測方法間差異無統計學意義(P＞0.05)。但在HBsAg含量低濃度的血清中，由于接近ELISA的最低檢出濃度，只有60%的陽性檢出率，有8例血清標本處于標本對臨界值(S/CO)以下而漏檢。采用配對資料的χ2檢驗，兩法的檢出率差異有統計學意義(χ2=10，P＜0.01)，見表1。

3 討論

表1 兩種方法檢測高、中、低三種濃度血清HBsAg結果的比較(n=60)

國內目前定性檢測乙肝HBsAg最常用的方法是酶聯免疫吸附實驗(ELISA)。ELISA屬于初篩實驗方法，該法簡單、方便、快速、成本低，敏感性可達0.7 ng/ml[4]，測定下限進口試劑盒可達0.2 ng/ml，國產試劑盒為0.5～2 ng/ml[5]，使用定性方法檢測HBsAg僅能對結果進行陰、陽性的判斷，這已無法滿足臨床的要求。在本實驗表1中兩種方法檢測的結果符合率為96.62%，說明了兩種方法檢查結果具有很高的一致性，但仍有少部分結果不符，這可能是ELISA法在操作中的影響因素較多，比如溶血、紅細胞等外源性物質，自身抗體、補體和易發生交叉反應的內源性物質以及手工加樣、洗板等操作因素都易引起實驗結果的假陽性；而抗體的包被質量及反應溫度、時間、鉤狀效應等都易引起實驗結果的假陰性，另外ELISA法不能用于定量檢測，這局限了ELISA的應用。在本實驗中，用兩種方法檢測標本HBsAg濃度旨在探討比較ELISA和TRFIA檢測該指標的敏感性，ELISA法檢測的20例高、中濃度標本均無漏檢，但在低濃度血清標本HBsAg＜5 ng/ml的檢測中，有8例假陰性，陽性率僅為60%，說明TRFIA的敏感性要高于ELISA，在實際工作使用TRFIA法可避免因外源性或內源性因素引起的漏檢和錯診。

時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)因使用鑭系元素作為標記物，有效排除背景熒光的干擾，提高了TRFIA法的靈敏度。而且時間分辨熒光免疫分析技術屬全自動檢測儀，能提供穩定、均一、可靠的試驗條件，避免由人為因素所引起的加樣誤差。與ELISA相比，用TRFIA定量測定乙肝病毒血清標志物給了臨床一個量化指標，能準確及時敏感地反映患者體內病毒標志物的含量，使結果更加直觀。近年來應用熒光定量PCR法檢測HBV DNA由于波動頻率和幅度較大，單獨使用很難精確識別非活動性HBV攜帶者，HBsAg定量與HBV DNA定量形成了信息互補，HBsAg定量可以作為病毒感染的標志，而HBV DNA定量則可以作為病毒復制的指標，兩種方法聯合應用可以識別非活動性HBV攜帶者。TRFIA對于HBsAg的檢測靈敏度0.05 ng/ml以下[6]，能對低水平存在的HBsAg進行有效檢測。在慢性肝炎(CHB)中HBV感染的自然史一般可分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低(非)復制期和HBeAg陰性肝炎期，其中在非活動期時HBsAg水平最低，使用TRFIA方法對HBsAg定量檢測可以用于準確判斷CHB所處的階段，具有重要的臨床意義。

綜上所述，TRFIA的敏感性要高于ELISA，在實際工作可避免引漏檢和錯診。而且HBsAg定量不僅可以反應慢性HBV感染史，便于觀察HBV感染動態和檢測低水平的HBV感染指標，尤其還可以對抗病毒治療應答情況進行預測。目前時間分辨免疫熒光分析儀只適用于成批檢測，不適于單份樣本操作，而且操作時間相對較長，仍有一定的缺陷，但是隨著檢驗技術的不斷進步，HBsAg定量檢測必將在臨床應用中發揮越來越大的作用。

[1]秦望森.兩種檢測乙肝血清學標志物方法的臨床對比[J].中國老年雜志,2011,31(7):226.

[2]Diamandis EP.Time-resolved fluorometry in nucleic acid hyBfidization and wtem Blotting techniques[J].Eleetrophoresis,1993,14(9): 866-875.

[3]潘麗,李玲艷,李胡煥,等.時間分辨與酶聯免疫檢測乙型肝炎表面抗體的結果分析[J].實用醫技雜志,2011,18(10):1064-1065.

[4]陳佑明,黃敬,劉京平.兩種方法檢測乙型肝炎病毒表面抗原的比較[J].檢驗醫學與臨床,2009,6(7):495-496.

[5]劉榮靜,習浩,林列坤.乙型肝炎病毒表面抗原弱反應性標本的檢測及臨床意義[J].檢驗醫學與臨床,2010,7(5):404-405.

[6]蔡軍,劉曉麗.時間分辨熒光免疫分析法測定乙肝HBsAg的臨床意義[J].山西醫科大學學報,2011,42(5):406-407.

Clinical application of time-resolved fluoroimmunoassay for detecting hepatitis B virus surface antigen.

WANG Xiong.Department of Clinical Laboratory,Lingshui County Maternal and Child Health Hospital,Lingshui 572400, Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical application of time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA) in quantitative measurement of hepatitis B virus surface antigen.MethodsQuantitative and qualitative analysis of 237 serum samples were detected by TRFIA and ELISA,respectively.Twenty samples of high,medium and low concentration of HBsAg were taken respectively for redetermination by the two methods.ResultsOf the 237 samples, 99 were positive for HBsAg with TRFIA assay,and 91 were positive for HBsAg with ELISA assay.There was no statistically significant difference between the two methods(P＞0.05).The 20 samples of high or medium concentration of HBsAg were all positive by both TRFIA and ELISA,with no statistically significant difference between two methods(P＞0.05).However,the detection rate with TRFIA assay was significantly higher than that with ELISA assay in the 20 samples of low concentration(P＜0.01).ConclusionTRFIA assay is more sensitive in quantitative detection of hepatitis B virus surface antigen.Moreover,TRFIA assay has more advantages than ELISA in detection of low concentration samples.We believe that TRFIAhas a higher application value.

Time-resolved fluorimmunoassay(TRFIA);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA); HBsAg;Quantitative detection

R512.6+2

A

1003—6350（2013）18—2693—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.18.1121

2013-03-21)

王雄。E-mail：www3630@163.com