支氣管哮喘小鼠外周血CD8+CD28-T細胞群和CD8+CD56+T細胞群作用機制研究

黃琳惠，黃奕江，蔡興俊，莫儒冰

(海南省人民醫(yī)院呼吸內科，海南海口570311)

支氣管哮喘小鼠外周血CD8+CD28-T細胞群和CD8+CD56+T細胞群作用機制研究

黃琳惠，黃奕江，蔡興俊，莫儒冰

(海南省人民醫(yī)院呼吸內科，海南海口570311)

目的研究哮喘小鼠外周血細胞與細胞間的關系及兩種細胞群在哮喘中的作用。方法30只BALB/c小鼠隨機分為對照組和哮喘組，每組各15只。測定小鼠的氣道反應性，對支氣管肺泡灌洗液行細胞學分類，觀察肺組織的病理變化，流式檢測小鼠外周血細胞及細胞的比例，分析哮喘中兩種細胞之間的相關性。結果成功建立小鼠哮喘模型。①哮喘組小鼠BALF中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞(%)較對照組明顯增高；②哮喘組小鼠外周血細胞及細胞比例均較對照組升高；③細胞與細胞數(shù)量上呈正相關(r=0.737，P=0.002)。結論哮喘時外周血細胞和細胞數(shù)目異常，兩種細胞正相關，可能在哮喘發(fā)病中起重要作用。

哮喘小鼠模型；氣道反應性；支氣管肺泡灌洗液；外周血；細胞

臨床研究顯示，長期使用皮質激素可能會抑制免疫系統(tǒng)的調節(jié)功能，破壞免疫穩(wěn)定，造成哮喘難治，因此，在哮喘的發(fā)病源頭或其上游抑制其變態(tài)反應或建立調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Tr)的抑制作用可能是治療哮喘的研究方。哮喘中氣道有大量Tr細胞浸潤。Tr細胞中主要的細胞表型為，后者能產(chǎn)生各種細胞因子發(fā)揮細胞毒效應[3]，并與各種細胞相互作用。本文通過新的方法建立哮喘小鼠模型，研究其外周血T細胞在哮喘發(fā)病中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物SPF級雌性BALB/c小鼠30只，3～5周齡，體重16～18 g，海南醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器卵蛋白(OVA)：美國Sigma公司；FITC anti-mouse CD8a,PE anti-mouse CD28，PE anti-mouse CD56a：美國biolegend公司；超聲波霧化器：廣東粵華牌。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及模型制備30只SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為哮喘組(n=15)和對照組(n=15)。哮喘組第0、14天給予小鼠腹腔注射致敏，每只每次給予含Ⅱ級OVA 5 mg及氫氧化鋁5 mg的生理鹽水混懸液200μl。第21天開始對小鼠給予4%OVA生理鹽水霧化液40 ml進行霧化激發(fā)，1次/d，每次40 min，連續(xù)7 d。對照組第0、14天腹腔注射致敏，每只每次給予含氫氧化鋁5 mg的生理鹽水混懸液200μl。于第21天開始對小鼠給予生理鹽水40 ml進行霧化激發(fā)，頻次和持續(xù)時間同哮喘組。

1.2.2 肺功能檢查末次激發(fā)48 h后，Buxco小鼠肺功能儀無創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應性。

1.2.3 肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)對小鼠氣管插管，PBS灌洗。BALF細胞涂片。固定后染色，連續(xù)計數(shù)400個細胞并行細胞分類，計算各細胞百分比。

1.2.4 肺組織病理學觀察將左肺上葉固定后包埋、切片、HE染色。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞表面分子采集小鼠外周血，處理后行相應熒光抗體染色，流式檢測，設立同型對照。

1.3 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x-±s)表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。相關性檢驗采用Pearson直線相關性分析；兩組間樣本均數(shù)的比較行t檢驗。以P＜0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺功能檢查結果采用無創(chuàng)肺阻抗法，通過小鼠肺功能儀測定小鼠的氣道反應性。給予300 μl生理鹽水霧化1 min，然后再測定濃度遞增的乙酰甲膽堿(Mch；3.12 mg/ml、6.25 mg/ml、12.50 mg/ml、25.00 mg/ml、50.00 mg/ml)霧化激發(fā)小鼠氣道反應性的變化，每次霧化1 min，記錄3 min，見表1。

表1 氣道反應性(mg/ml)

表1 氣道反應性(mg/ml)

組別對照組哮喘組t值P值生理鹽水0.542±0.087 0.573±0.109 0.714 0.484 Mch3.12 0.628±0.073 0.684±0.076 1.678 0.111 Mch 6.25 0.675±0.176 1.260±0.086 9.463 0.000 Mch 12.5 1.085±0.370 2.585±0.423 8.437 0.000 Mch 25.00 1.887±0.491 3.980±1.051 5.705 0.000 Mch 50.00 2.606±0.793 7.895±1.415 10.314 0.000

2.2 BALF細胞總數(shù)和分類比較①BALF細胞總數(shù)：哮喘組顯著高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。②BALF嗜酸性粒細胞百分率：哮喘組顯著高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。③BALF中性粒細胞百分率和淋巴細胞百分率：哮喘組顯著高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表2。

表2 兩組BALF中細胞總數(shù)和分類的比較(n=15，%)

表2 兩組BALF中細胞總數(shù)和分類的比較(n=15，%)

組別對照組哮喘組t值P值例數(shù)15 15 Neu 5.67±1.45 30.63±4.88 -11.479 0.000細胞總數(shù)(×105/ml) 0.52±0.43 1.72±0.15 -14.152 0.000 Eos 0.72±1.09 27.11±4.06 23.328 0.000 Lym 10.52±3.11 21.48±4.30 5.129 0.000

2.3 肺組織病理學觀察結果哮喘組支氣管、血管周圍、肺泡腔內可見嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤，氣道上皮損傷，杯狀細胞肥大增生，氣道內黏液栓形成。對照組肺組織氣道結構清晰，氣道纖毛上皮排列整齊，無明顯炎癥改變，見圖1。

2.4 外周血CD8+CD28-T、CD8+CD56+T細胞流式檢測結果哮喘組和對照組CD8+CD28-T細胞分別為(13.65±3.075)%和(10.32±2.318)%，CD8+CD56+T細胞分別為(4.11±1.47)%和(2.59±1.19)%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CD8+CD28-T細胞與CD8+CD56+T細胞存在正相關(r=0.737，P=0.002)，見圖2、圖3和圖4。

圖1 病理切片(×200)

圖2 外周血T細胞流式檢測結果

圖3 外周血CD8+CD56+T細胞流式檢測結果

圖4 CD8+CD28-T細胞與CD8+CD56+T細胞的相關分析

3 討論

支氣管哮喘是T淋巴細胞參與的體液免疫過程，也是T淋巴細胞活化、增殖過強，凋亡減弱的過程。Filaci等[2]發(fā)現(xiàn)，CD8+調節(jié)T淋巴細胞有三種不同亞群，Ⅰ、Ⅱ型T細胞表型為CD8+CD28-。本研究通過建立哮喘小鼠模型，檢測小鼠外周血CD8+CD28-T細胞及CD8+CD56+T細胞的比例，分析兩種細胞亞型之間的相關性，探討CD8+CD28-T細胞和CD8+CD56+T細胞在哮喘發(fā)病中的作用。

哮喘是以大量表達CD8+CD56+細胞和CD8+CD28-T細胞為特點[4]，我們的實驗也證明了這點。上述兩種細胞亞群都存在于健康和哮喘小鼠，但在哮喘小鼠外周血中，CD8+CD28-T細胞及CD8+CD56+T細胞亞型的數(shù)量均較對照組明顯增加。Chamberlain等[5]發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞效應性細胞毒作用主要存在于CD28-細胞群，CD28表達缺失標志著作用上分化成為細胞毒性記憶細胞。其他研究也證明，外周血CD8+CD28-T細胞克隆有著較短的質粒，對凋亡有著更強的抵抗[6]。在哮喘和COPD患者及其他自身免疫異常的慢性炎癥，如多發(fā)性硬化[7-8]患者外周血都有CD8+CD28-T細胞和穿孔素的表達較健康人的明顯增加，CD8+CD28-T細胞即是以大量產(chǎn)生穿孔素、TNF-α、IFN-γ從而在自身免疫疾病中發(fā)揮調節(jié)作用為特點的細胞群[9]。哮喘加劇期間，炎癥的表現(xiàn)更傾向于抗病毒反應，而不是對抗嗜酸性粒細胞為主的免疫應答[10]，提示T細胞在介導哮喘及決定糖皮質激素治療的有效性方面有著獨立作用。

CD8+CD56+細胞是哮喘中另一主要的細胞亞型。它們與CD8+CD28-細胞在哮喘中存在著密切的正相關(r=0.737)。CD56，CD158b等標志是常見自然殺傷(NKT)細胞的受體，Umetsu等[11]證明NKT細胞和T細胞在哮喘中的啟動作用及它們在機體中同時對TH2細胞因子、CD8+細胞、NKT細胞進行調控的關鍵步驟。因此，CD8+CD56+和CD8+CD28-T細胞在哮喘的發(fā)病過程中是存在密切聯(lián)系的，但是要了解這兩種細胞在哮喘中的相互作用細節(jié)，還需要更進一步的研究。

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Function and mechanism of CD8+CD28-T cells and CD8+CD28-T cells in peripheral blood of asthmatic mouse model.

HUANG Lin-hui,HUANG Yi-jiang,CAI Xing-jun,MO Ru-bing.Department of Respiratory Medicine,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the relationship betweenT cells in peripheral blood of mice and the function of the two subsets in the development of asthma.MethodsThirty Balb/c mice were randomly divided into two groups:asthma group,control group,with 15 mice in each group.The airway responsiveness were measured,bronchoalveolar lavage cytology was performed and lung tissue sections were prepared for histopathologic examination to evaluate the airway inflammation,examine the fraction ofT cells by flow cytometry and correlation analysis.ResultsThe mouse models established successfully.①The total cell number and the percentages of eosinophils in BALF of the asthmatic group were significantly higher than that in the control group;②The percentages ofT cells in peripheral blood[(13.65±3.075)vs(4.11± 1.47)]in asthmatic group were significantly higher than that in control group[(10.32±2.318)vs(2.59±1.19)].③There was a strong positive correlation betweenT cells(r=0.737,P=0.002).ConclusionThe fractions ofT cells are associated with asthma ongoing closely,and there is a strong positive correlation between these two subsets.

Airway responsiveness;Bronchoalveolar lavage fluid;Peripheral blood;CD56+T cell

R-332

A

1003—6350（2013）18—2658—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.18.1107

2013-05-15)

黃琳惠。E-mail：rochelle-11@163.com