外加營養源作用下磚紅壤中五氯酚還原轉化的 生物化學作用機制

陳曼佳，劉承帥，吳偉堅，童輝，李芳柏*

1. 中國科學院廣州地球化學研究所，廣東 廣州 510640；

2. 廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東省生態環境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3. 中國科學院大學，北京 100039

五氯酚（pentachlorophenol，PCP）是自然界中普遍存在的高毒、難降解的持久性有機氯污染物，在過去的30年中，五氯酚被廣泛應用于殺蟲、殺菌、防腐等生產生活領域[1-2]。PCP的大規模使用已經造成了濕地、水體、土壤等大范圍的污染，并威脅到人類的健康[3-5]。

氯酚在缺氧土壤環境中經歷著緩慢的自然還原轉化過程[6-7]，包括非生物和生物轉化過程。氯酚在土壤中的非生物轉化通常是由各種潛在氧化還原劑引起，尤其是含低價態鐵及其鐵氧化物等自然礦物界面[6]。微生物在土壤地球化學過程中扮演著極其重要的角色。早在1986年，Valo和Salkinoja-salonen報道了Rhodococcus chlorophenolicus對土壤中苯氧基苯酚和多氯苯氧基苯甲醚進行還原脫氯[8]。土壤中氯酚還原轉化通常既發生生物轉化，又同時伴隨著非生物轉化[9-10]。在厭氧土壤環境中，非生物和生物過程可能共同促進氯酚的還原轉化過程。

在厭氧富鐵紅壤中，吸附態Fe（Ⅱ）被認為是PCP還原轉化的活性物種[11-13]。但是，在土壤環境中的鐵大部分是以含鐵土壤礦物組成成分的形式存在，很難直接作用于PCP的還原轉化。在厭氧條件下，土壤氧化鐵能夠通過還原性有機酸 [14-15]和異化鐵還原微生物驅動等作用產生大量的土壤礦物吸附態Fe（Ⅱ）物種[16]，從而促進土壤中有機氯污染物的還原轉化。

玄武巖磚紅壤是廣東省熱帶地區代表性土壤，其鐵氧化物和有機質的含量都較高[17]，因此，玄武巖磚紅壤中PCP具有活躍的環境地球化學過程，同時，其中的微生物群落結構也與PCP轉化具有密切關系。但是，與之相關磚紅壤中PCP轉化的微生物作用過程機制，還需進一步研究。

因此，本研究以玄武巖發育的磚紅壤為基質，在中性厭氧環境下，系統研究PCP還原轉化過程及其微生物群落結構的變化，在此基礎上深入探討紅壤體系對PCP的消減能力及反應機制，為促進土壤中有機氯污染物的還原轉化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤樣品為玄武巖磚紅壤，采自廣東省雷州市唐家鎮（20°51′N, 109°53′E），按多點采樣的方式采集深度為0~15 cm的土壤，土壤樣品在實驗室自然風干后，去除動植物殘體，過0.180 mm篩。供試土壤的理化性質經常規分析方法分析：土壤pH 4.79，有機質含量25.1 g/kg，總鐵137.27 g/kg，絡合態鐵0.076 g/kg，無定形鐵1.879 g/kg，游離態鐵16.97 g/kg。

1.2 實驗設計

實驗設計見表1，反應體系為0.5 g土壤（干質量），PCP、哌嗪-1,4-雙（2-乙烷磺酸）（PIPES）、乳酸和蒽醌-2,6-磺酸鈉（AQDS）的初始濃度分別為0.019、30、10和0.2 mmol·L?1。通過PIPES緩沖溶液將pH值控制在7.0左右。反應體系在20.2 mL的西林瓶中進行，高純氮氣充氣30 min排氧，然后用橡膠塞壓緊并用鋁蓋密封。樣品置厭氧培養箱中（30 ± 1）℃靜置培養，每隔一定時間取樣，測定樣品中目標物、吸附態Fe（Ⅱ）、氧化還原電位、胞外電子傳遞數量以及微生物群落結構。每個樣品設置3個重復，文中所示數據均為數據平均值。

表1 實驗設計條件 Table 1 Experimental design

1.3 實驗方法

反應體系樣品中目標物PCP采用1:1 (V:V)乙醇水溶液進行提取后[18]，高效液相色譜（HPLC）測定；吸附態Fe(Ⅱ)由0.5 mol·L?1鹽酸提取[16]，其濃度采用分光光度計測定，活性鐵物種的氧化還原電位（Ep）采用循環伏安法（CV）與傳統的三電極體系測試[19]，胞外電子傳遞數量采用微生物燃料電池(MFC)的方法進行測定[19]。具體的測試方法及過程見參考文獻[20]。土壤滅菌處理采用γ射線輻照滅菌（60Co源，輻照劑量為50 kGy）[21]。

1.4 微生物群落結構分析方法

1.4.1 土壤DNA提取

土壤DNA提取采用MO BIO公司的PowerSoilTMDNA試劑盒進行提取，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.4.2 細菌16S rRNA片段的PCR擴增和純化

采用通用引物擴增細菌16S rRNA。正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），其中正向引物5′用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標記，用于末端限制性片段長度多態性分析（T-RFLP）實驗。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成標記。PCR的反應體系如下：總體積25 μL，其中Ex Taq DNA聚合酶（TAKARA）1 U，聚合酶緩沖溶液2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正反向引物各0.4 μmol·L?1，模板50 ng，補充無菌水至25 μL。PCR反應條件如下：94 ℃ 4 min，30個循環為：94 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 1.5 min；72 ℃最終延伸10 min。PCR產物用純化試劑盒（OMEGA）純化，具體方法流程按照說明書進行。

1.4.3 末端限制性片段長度多態性分析（T-RFLP）試驗

末端熒光標記的PCR純化后產物用MspI（TAKARA）限制性內切酶進行消化，反應體系為20 μL，其中酶8 U，10 × buffer 2 L，DNA 200 ng，37 ℃下消化3 h，然后升溫至70 ℃將酶滅活20 min。酶切產物的T-RFLP分析由上海基康生物技術有限公司完成。T-RFLP圖譜中限制性片段（T-RF）在50 ~ 550 bp，豐度小于1%的T-RFs不計入計算。T-RFs定性分析采用網站在線分析（http：//trflp.limnology.wisc.edu/index.jsp），選擇在線分析中的PAT（The T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool）工具。

2 結果與討論

2.1 PCP轉化動力學

圖1 不同反應條件下PCP還原轉化動力學 Fig. 1 Reductive transformation kinetics of PCP

PCP在玄武巖磚紅壤中的還原轉化動力學如圖1所示。由圖可知，在滅菌體系中（SC處理），PCP沒有發生還原轉化。其他3個體系中，PCP的還原轉化速率依次為T3>T2>T1。在只有PIPES作為緩沖溶液的體系下（T1處理），反應90 d之后，大約有10.8%的PCP發生轉化，其轉化一級動力學常數k為4.5 × 10?3d?1（R2= 0.943）。結果說明了土壤中的微生物對PCP的還原轉化起著決定性作用。有文獻[22-24]報道，通過生物刺激的作用，可以提高土壤中土著微生物的活性，從而進一步提高有機氯污染的脫氯轉化。在本研究中，當添加外加營養源乳酸作為電子供體時（T2處理），PCP轉化速率得到提高，17.5%的PCP發生轉化（k = 7.3 ×10?3d?1，R2= 0.947）。當同時添加乳酸和電子介體AQDS時（T3處理），PCP的轉化速率進一步提高，30.2%的PCP發生轉化（k = 14.3×10?3d?1，R2= 0.958）。結果表明，在外加營養源作用下，供試磚紅壤中微生物活性提高，同時，電子介體能提高反應體系中電子傳遞速率，從而提高PCP的還原轉化速率。

2.2 吸附Fe(Ⅱ)生成動力學

Li等[11-12]研究表明，土壤中鐵物種的地球化學循環過程能影響PCP還原轉化過程，還原性Fe(Ⅱ)物種能夠顯著促進PCP還原轉化率。本研究供試土壤樣品具有較高的總鐵以及各種形態的鐵含量，因此本研究系統考察了PCP降解過程中活性鐵物種的生成動力學，進一步研究鐵物種對PCP轉化的影響。圖2為反應過程中產生的吸附態Fe(Ⅱ)濃度變化。從圖中可以看出，在滅菌體系中，產生的吸附態Fe(Ⅱ)最高濃度只有0.18 mmol·L?1。而隨著反應時間的增加，T1-T3體系中，吸附態Fe(Ⅱ)濃度呈現持續上升趨勢，說明添加電子供體乳酸能促進吸附態Fe(Ⅱ)物種的形成，而加入電子介體AQDS能進一步提高體系當中Fe(Ⅱ)生成量。

圖2 PCP還原轉化過程中吸附態Fe(Ⅱ)生成動力學 Fig. 2 Adsorbed Fe(Ⅱ) generation during the PCP transformation

2.3 反應體系中氧化還原電位的變化

采用循環伏安法測定了T1-T3反應體系中前10天活性鐵物種的氧化還原電位Ep，結果如圖3所示。T1體系中，在反應后期Ep值沒有明顯變化；而T2和T3體系中，隨著反應時間的增加，其Ep值不斷變小。這表明在T2和T3體系中，活性Fe(Ⅱ)物種的數量不斷增多，反應體系的還原能力持續提高。Glass等[25]指出，土壤的氧化還原電位越低，土壤有機氯污染物的還原轉化速度越快，而還原態的Fe物種是影響淹水土壤中氧化還原狀態的重要因素之一。由此可見，T3處理中生成的吸附態Fe(Ⅱ)具有較強的還原能力，這也是T3體系中具有較高的PCP還原轉化效率的主要原因。

圖3 PCP還原轉化過程中氧化還原電位變化 Fig. 3 Change of redox potential (Ep) generated during the PCP transformation processes

2.4 PCP轉化過程中土壤微生物群落結構變化

圖4 4個不同處理下土壤微生物的T-RFLP分析結果 Fig. 4 T-RFLP analysis of bacteria in four treatments

前面研究結果表明，在PCP還原脫氯過程中，土壤樣品中微生物起到重要的作用。因此，本研究采用T-RFLP方法對反應7 d的T1-T3體系中微生物群落結構進行解析。實驗過程設計不加PCP的處理（CK處理）供試土壤作為對照，研究PCP對微生物群落結構變化的影響。采用MspⅠ進行酶切，酶切產生的片段類型統計結果如圖4所示，其中片段豐度小于5%的所有片段歸為一類（圖中others所示），豐度大于10%定義為該處理條件下的優勢種群。CK處理下，共檢測到14個T-RF片段；T1-T3處理,分別檢測到10、7和4個T-RF片段。具體每個T-RF代表物種類型及豐度如表2所示。

表2 T-RFLP圖譜分析不同處理下土壤細菌主要種群 Table 2 Dominating bacteria based on T-RFLP profiles by PAT T-RFLP program

CK處理下，微生物群落結構的多樣性最高，其優勢種群為477 bp和484 bp，分別與根瘤菌和梭菌末端片段一致；T1處理下，其優勢種群為120 bp和484 bp，分別與脂肪酸芽孢桿菌和梭菌末端片段一致；T2處理下，其優勢種群為484 bp和518 bp，均與梭菌末端片段一致；T3處理下，其優勢種群為286 bp和288 bp，均與梭菌末端片段一致。由此可以推測，在供試土壤樣品中，梭菌是絕對優勢種群，尤其是添加乳酸和AQDS之后，其含量超過30%；由表2同時可知，T2處理中的片段509 bp與希瓦氏菌（典型鐵還原菌）片段一致。結果說明，在外加營養源作用下，與對照處理相比，鐵還原菌豐度增加。對4個處理下微生物群落結構進行主成分分析（PCA）發現[26]，在研究的4個不同處理條件下，其微生物群落結構存在明顯差異（圖5），第一主成分主要把添加PCP的樣品點與對照試驗點分開。T1-T3處理，其差異性主要表現在第二主成分。

圖5 4個不同處理下微生物群落結構主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of microbial community in the four treatments

3 結論

在玄武巖磚紅壤中，存在一定豐度的希瓦氏菌，厭氧條件下，氧化鐵能被還原形成吸附態Fe(Ⅱ)物種，吸附態Fe(Ⅱ)是土壤有機氯還原轉化的重要活性物質[11-12,27]。乳酸作為電子供體，為微生物提供可利用碳源[22]，外加乳酸時，土壤中的希瓦氏菌的豐度有所增強，促進了土壤中吸附態Fe(Ⅱ)的形成，從而提高了PCP的還原轉化率。

醌基類物質如腐殖質和AQDS作為電子介體，能提高體系的電子轉移速率[28]。因此，磚紅壤反應體系中加入AQDS能顯著提高PCP的還原轉化率。

玄武巖磚紅壤中PCP還原轉化的活性物質是吸附態Fe(Ⅱ)，希瓦氏菌是土壤中吸附態Fe(Ⅱ)生成的驅動者。添加乳酸和AQDS促進了吸附態Fe(Ⅱ)的生成，從而加速PCP的還原轉化。

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