應(yīng)用多重PCR方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌的研究

王桂榮 付育紅 梁倩 尚媛媛 姜廣路 趙立平 于霞 陳素婷 黃海榮

·論 著 ·

應(yīng)用多重PCR方法快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌的研究

王桂榮 付育紅 梁倩 尚媛媛 姜廣路 趙立平 于霞 陳素婷 黃海榮

目的 建立并評(píng)估快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）與非結(jié)核分枝桿菌（NTM）的多重PCR方法。方法 應(yīng)用分別針對(duì)MTBC的oxyR-ahpC基因間隔區(qū)、MTBC和NTM的rpoB基因可變區(qū)的3對(duì)分枝桿菌特異性引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為473 bp、235 bp和136 bp。應(yīng)用該多重PCR方法對(duì)6株MTBC標(biāo)準(zhǔn)株、50株NTM標(biāo)準(zhǔn)株、312株MTBC臨床分離株和300株NTM臨床分離株進(jìn)行了初步菌種鑒定。結(jié)果 經(jīng)多重PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳，MTBC標(biāo)準(zhǔn)株473 bp和235 bp片段均可見(jiàn)，NTM標(biāo)準(zhǔn)株僅見(jiàn)136 bp片段。312株MTBC臨床分離株中，310株擴(kuò)增出473 bp和235 bp片段，敏感度為99.36%（310/312），特異度為99.32% （294/296）；300株NTM臨床分離株中，294株擴(kuò)增出136 bp片段，敏感度為98.00%（294/300），特異度為100.00%（310/310）。結(jié)論 該多重PCR方法可檢測(cè)并鑒別MTBC及NTM，具有高度的特異度和敏感度，有可能作為鑒別MTBC與NTM的有價(jià)值的檢測(cè)手段。

分枝桿菌，結(jié)核； 分枝桿菌屬； 多重聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核病的主要致病菌是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC），然而近年來(lái)非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染亦呈不斷上升趨勢(shì)［1］。MTBC與NTM在臨床上引起的疾病難以區(qū)別，但兩者治療方案明顯不同［2］。因此，快速準(zhǔn)確地鑒定MTBC與 NTM，對(duì)結(jié)核病的早期診斷、早期治療，以及對(duì)結(jié)核病疫情的控制均具有重要意義。

傳統(tǒng)的分枝桿菌鑒定方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，且對(duì)分類密切相關(guān)的菌種難以區(qū)分。雖然在臨床標(biāo)本的檢測(cè)中分子生物學(xué)方法不能替代培養(yǎng)法，但它們的互相結(jié)合可加速分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷。Mokaddas等［3］根據(jù)MTBC成員（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）的oxyR基因都存在天然突變，無(wú)活性，而在NTM中oxyR基因無(wú)突變，是一個(gè)有功能的基因，在2007年選用oxy R-ahpC基因間隔區(qū)和rpoB基因的可變區(qū)建立了一種鑒定MTBC與NTM的多重PCR方法，用常見(jiàn)細(xì)菌、真菌，包括大腸埃希菌、沙門(mén)菌、彎曲桿菌、幽門(mén)螺旋桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和煙曲菌和少量分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株評(píng)價(jià)了該方法的特異性，并應(yīng)用少量分枝桿菌臨床株對(duì)此方法進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］優(yōu)化了Mokaddas所建立的方法，簡(jiǎn)化了操作步驟，并應(yīng)用56株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和612株分枝桿菌臨床分離株評(píng)估了所建立的快速鑒定MTBC與NTM多重PCR方法的可靠性。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

6株MTBC標(biāo)準(zhǔn)株和50株NTM標(biāo)準(zhǔn)株均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室保存（表1）；312株MTBC臨床分離株和300 株NTM臨床分離株來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院和（或）門(mén)診患者。312株MTBC臨床分離株中176株來(lái)自肺結(jié)核患者，136株來(lái)自骨結(jié)核患者；300株NTM臨床分離株中130株為胞內(nèi)分枝桿菌，71株為膿腫分枝桿菌，32株為堪薩斯分枝桿菌，25株為偶然分枝桿菌，20株為鳥(niǎo)分枝桿菌，12株為戈登分枝桿菌，4株為M.arupense，2株為M.holsaticum，1株為副瘰疬分枝桿菌，1株為瘰疬分枝桿菌，1株為瑪爾摩分枝桿菌，1株為諾卡分枝桿菌。

菌株分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［4］。MTBC和NTM臨床分離株的鑒定依靠含對(duì)硝基苯甲酸（PNB）羅氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)確定，對(duì)300株NTM臨床分離株通過(guò)測(cè)定基因16S rDNA、rpoB和16S-23s rRNA ITS（轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）的序列進(jìn)行菌種鑒定［5-7］。

二、主要儀器和試劑

PCR儀為美國(guó)ABI公司9700型；凝膠成像儀為BIO-RAD公司Gel Doc 2000型；PCR試劑及DNA Ladder均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

三、方法

1.細(xì)菌DNA的制備：刮取一接種環(huán)新鮮培養(yǎng)的分枝桿菌至200μl滅菌去離子水中，煮沸15 min；離心半徑5 cm，12 000 r/min，離心10 min，取上清備用。

2.PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)文獻(xiàn)［3］設(shè)計(jì)了3對(duì)分枝桿菌特異性引物，1對(duì)為針對(duì)MTBC的oxy R-ahpC基因間隔區(qū)的特異引物：IGRF和IGRR；應(yīng)用該引物，以MTBC為模版可擴(kuò)增出473 bp的目的片段，而以NTM為模版則無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；另外2對(duì)分別為針對(duì)MTBC和NTM的rpoB基因可變區(qū)的特異性引物，MTBC特異性引物為MTBCF和MTBCR，擴(kuò)增產(chǎn)物為235 bp；NTM特異性引物為NTMF 和NTMR，擴(kuò)增產(chǎn)物為136 bp。具體見(jiàn)表2。

表1 56株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株

3.PCR擴(kuò)增及電泳：Mokaddas等所建立的方法中采用50μl PCR反應(yīng)體系，并應(yīng)用梯度PCR法，該方法所需試劑較多而且耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)儀器的要求也較高。本研究通過(guò)摸索建立了25μl PCR反應(yīng)體系，包括Extaq PCR mix 12.5μl，3對(duì)引物各1μl（每條濃度為10 pmol/μl），DNA模版2μl及去離子水4.5μl。并建立了兩步PCR擴(kuò)增方法，條件為：94℃5 min、94℃1 min、68℃1 min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存，該擴(kuò)增方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈檢測(cè)。

表2 引物的具體序列和片段長(zhǎng)度

結(jié) 果

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)結(jié)果：應(yīng)用此種多重PCR方法檢測(cè)分枝桿菌DNA，其結(jié)果與預(yù)期相同：6株MTBC標(biāo)準(zhǔn)株均可見(jiàn)473 bp和235 bp的特異性擴(kuò)增片段；50株NTM標(biāo)準(zhǔn)株可見(jiàn)136 bp的特異性擴(kuò)增片段，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株多重PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 96株NTM臨床分離株多重PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.臨床分離株檢測(cè)結(jié)果：312株MTBC臨床分離株中，310株擴(kuò)增出與 MTBC標(biāo)準(zhǔn)株相同的473 bp和235 bp片段，敏感度為99.36%（310/312），特異度為99.32%（294/296）；300株NTM臨床分離株中，294株擴(kuò)增出與NTM標(biāo)準(zhǔn)株相同的136 bp片段，敏感度為98.00%（294/300），特異度為100.00% （310/310）。

6株NTM臨床分離株的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果與基因測(cè)序鑒定結(jié)果存在不一致，其中2株NTM臨床分離株擴(kuò)增出了473、235和136 bp 3條片段，4株擴(kuò)增出了473和235 bp 2條片段，結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)這6株NTM臨床分離株進(jìn)行進(jìn)一步的同源基因測(cè)序聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原膠體金檢測(cè)試劑盒檢測(cè)（結(jié)果未顯示），結(jié)果表明這6株NTM臨床分離株均存在NTM與結(jié)核分枝桿菌混合感染。

討 論

傳統(tǒng)的生化方法可用于鑒別MTBC與NTM，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，已很少使用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有一些文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用PCR或PCR相關(guān)技術(shù)快速檢測(cè)、鑒別MTBC與NTM。然而，有些方法卻易產(chǎn) 生 假 陽(yáng) 性 或 假 陰 性 結(jié) 果［8-10］，如IS6110同源序列不僅存在于MTBC中，也存在于潰瘍分枝桿菌、淺黃分枝桿菌等6種NTM中和肺炎鏈球菌、Pyogenes鏈球菌、fumigatus曲霉菌中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)某些結(jié)核分枝桿菌菌株缺乏IS6110插入序列，前者可能是用PCR擴(kuò)增該靶基因序列檢測(cè)鑒定MTBC產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因之一，后者則是產(chǎn)生假陰性的原因之一。核酸雜交診斷分枝桿菌（如商品化的INNO-LiPA Mycobacteria和Accu-Probe）特異度高，但成本昂貴，并且目前能鑒定的菌種有限，因此上述方法難以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用［11-12］。對(duì)分枝桿菌的目的基因如16S rDNA［5］、rpoB［6］、hsp65［13］、sec A［14］和16S-23S rRNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）［7］進(jìn)行DNA測(cè)序幾乎可將所有分枝桿菌鑒定至種水平，然而對(duì)所有臨床樣品都進(jìn)行DNA測(cè)序成本太高，在發(fā)展中國(guó)家還很難推廣。因此臨床急需建立一種簡(jiǎn)單、便宜、可信的初步鑒別MTBC與NTM的方法，然后再根據(jù)需要對(duì)樣品進(jìn)一步鑒定至種水平，這樣既可提高鑒定速度又可節(jié)約成本。

由于所有MTBC成員（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）的oxyR基因都存在天然突變，導(dǎo)致在MTBC中oxyR基因無(wú)活性，而在NTM中oxy R基因無(wú)突變是一個(gè)有功能的基因［15］。Mokaddas等［3］在2007年選用oxy R-ahpC基因間隔區(qū)和rpoB基因的可變區(qū)建立了一種鑒定MTBC與NTM的多重PCR方法。Mokaddas等［3］應(yīng)用常見(jiàn)細(xì)菌和真菌驗(yàn)證了該方法的特異度較高，表明此3對(duì)引物在常見(jiàn)細(xì)菌和真菌（大腸埃希菌、沙門(mén)菌、彎曲桿菌、幽門(mén)螺旋桿菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌和煙曲菌）中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，而在MTBC菌株中可擴(kuò)增出473 bp和235 bp片段，在NTM菌株中可擴(kuò)增出136 bp片段。同時(shí)也檢測(cè)了該方法的敏感度，當(dāng)模版中最低含有20 pg的DNA，相當(dāng)于4000個(gè)分枝桿菌時(shí)，即可獲得陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，說(shuō)明該方法敏感度高。本研究所使用的多重PCR方法與Mokaddas等［3］所建立的方法原理一致，但簡(jiǎn)化了操作步驟，優(yōu)化了反應(yīng)條件，如用普通PCR方法替代了梯度PCR，用兩步PCR法代替了三步PCR法，在未降低反應(yīng)的敏感度和特異度的情況下，節(jié)約了成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

對(duì)于存在混合感染的樣品，應(yīng)用本研究中的多重PCR方法理論上應(yīng)能擴(kuò)增出473、235和136 bp 3條片段，但由于樣品中NTM與結(jié)核分枝桿菌混合比例不同，也可能僅出現(xiàn)473和235 bp 2條片段，或是僅出現(xiàn)136 bp 1條片段。因此，當(dāng)應(yīng)用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行鑒定時(shí)，若出現(xiàn)與其他鑒定方法結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)考慮存在混合感染的情況。

應(yīng)用本研究中的3對(duì)引物鑒定MTBC臨床分離株的敏感度為99.36%，特異度為99.32%；鑒定NTM臨床分離株的敏感度為98.00%，特異度為100.00%，說(shuō)明該方法具有較高的敏感度和特異度。另外整個(gè)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，并且所使用的試劑非常便宜，使得該技術(shù)具有很高的可行性。

［1］Katoch VM.Infections due to non-tuberculous mycobacteria （NTM）.Indian J Med Res，2004，120（4）：290-304.

［2］Frieden TR，Sterling TR，Munsiff SS，et al.Tuberculosis. Lancet，2003，362（9387）：887-899.

［3］Mokaddas E，Ahmad S.Development and evaluation of a multiplex PCR for rapid detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex members from non-tuberculous mycobacteria.Jpn J Infect Dis，2007，60（2/3）：140-144.

［4］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.北京：中國(guó)教育文化出版社，2006.

［5］Kirschner P，B?ttger EC.Species identification of mycobacteria using rDNA sequencing.Methods Mol Biol，1998，101：349-361.

［6］Lee H，Bang HE，Bai GH，et al.Novel polymorphic region of the rpoB gene containing Mycobacterium species-specific sequences and its use in identification of mycobacteria.J Clin Microbiol，2003，41（5）：2213-2218.

［7］Roth A，F(xiàn)ischer M，Hamid ME，et al.Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences.J Clin Microbiol，1998，36（1）：139-147.

［8］Liébana E，Aranaz A，F(xiàn)rancis B，et al.Assessment of genetic markers for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis complex.J Clin Microbiol，1996，34（4）：933-938.

［9］Kent L，Mc Hugh TD，Billington O，et al.Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp.JClin Microbiol，1995，33 （9）：2290-2293.

［10］Magdalena J，Vachée A，Supply P，et al.Identification of a new DNA region specific for members of Mycobacterium tuberculosis complex.J Clin Microbiol，1998，36（4）：937-943.

［11］Tortoli E，Mariottini A，Mazzarelli G.Evaluation of INNOLiPA MYCOBACTERIA v2：improved reverse hybridization multiple DNA probe assay for mycobacterial identification.J Clin Microbiol，2003，41（9）：4418-4420.

［12］Russo C，Tortoli E，Menichella D.Evaluation of the new Geno Type Mycobacterium assay for identification of mycobacterial species.J Clin Microbiol，2006，44（2）：334-339.

［13］McNabb A，Adie K，Rodrigues M，et al.Direct identification of mycobacteria in primary liquid detection media by partial sequencing of the 65-kilodalton heat shock protein gene.J Clin Microbiol，2006，44（1）：60-66.

［14］Zelazny AM，Root JM，Shea YR，et al.Cohort study of molecular identification and typing of Mycobacterium abscessus，Mycobacterium massiliense，and Mycobacterium bolletii.J Clin Microbiol，2009，47（7）：1985-1995.

［15］Deretic V，Philipp W，Dhandayuthapani S，et al.Mycobacterium tuberculosis is a natural mutant with an inactivated oxidative-stress regulatory gene：implications for sensitivity to isoniazid.Mol Microbiol，1995，17（5）：889-900.

Study on rapid differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex from non-tuberculous mycobacteria by a multiplex PCR

WANG Gui-rong，F(xiàn)U Yu-hong，LIANG Qian，SHANG Yuan-yuan，JIANG Guang-lu，ZHAO Li-ping，YU Xia，CHEN Su-ting，HUANG Hai-rong. National Tuberculosis Clinical Laboratory，Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Institute，Beijing Chest Hospital，Capital Medical University，Beijing 101149，China

HUANG Hai-rong，Email：hairong.huangcn@gmail.com

Objective To establish and evaluate a multiplex PCR technique to rapid differentiate Mycobacterium tuberculosis complex（MTBC）from non-tuberculous mycobacteria（NTM）.Methods Three pairs of oligo nucleotide primers were used in the multiplex PCR reaction.A 473 bp DNA fragment encoding oxyR-ahpC intergenic region in MTBC，a 235 bp and 136 bp DNA fragment encoding variable rpoB gene region from MTBC and NTM，respectively，were amplified.The multiplex PCR was assessed in 6 reference strains of MTBC，50 reference strains of NTM，312 clinical strains of MTBC and 300 clinical strains of NTM.Results The multiplex PCR produced two DNA fragments at the size 473 bp and 235 bp for MTBC reference strains，and one DNA fragment with the size 136 bp for NTM reference strains.Among 312 MTBC clinical samples，the sensitivity was 99.36% （310/312）and specificity was 99.32%（294/296）.Among 300 NTM clinical samples，the sensitivity and specificity were 98.00%（294/300）and 100.00%（310/310）respectively.Conclusion The multiplex PCR can differentiate MTBCand NTM efficiently，and might be a valuable technique for clinical use.

Mycobacterium tuberculosis； Mycobacterium； Multiplex polymerase chain reaction

2013-03-26）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

北京市自然科學(xué)基金（7132049）

101149首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室

黃海榮，Email：hairong.huangcn@gmail.com