重慶市結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關耐藥性分析

汪曉艷 趙雁林 逄宇 王玉峰 萬康林 劉潔 劉英 沈靜 杜昌廷 張舜

·論 著 ·

重慶市結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型及相關耐藥性分析

汪曉艷 趙雁林 逄宇 王玉峰 萬康林 劉潔 劉英 沈靜 杜昌廷 張舜

目的 對重慶市結核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型，研究不同基因型在重慶的流行情況，并分析基因型與耐藥表型的關系。方法 收集2011年1—12月重慶市結核病防治所分離的113株結核分枝桿菌臨床分離株，采用比例法進行藥物敏感性檢測；應用間隔區寡核苷酸分型（Spoligotyping）和PCR方法對113株結核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型。結果 在113株結核分枝桿菌臨床分離株中，可分為北京家族和非北京家族，分別占77株（68.1%，77/113）和36株（31.9%，36/113）；北京家族菌株中現代型為48株（62.3%，48/77），古代型為29株（37.7%，29/77）；非北京家族菌株中，T1型高達13株（36.1%，13/36），發現9種新基因型。北京家族菌株耐藥率為24.7%（19/77），非北京家族菌株耐藥率為38.9%（14/36），差異無統計學意義（χ2=2.40，P＞0.05）?，F代型北京家族菌株耐藥率為27.1%（13/48），古代型北京家族菌株耐藥率為20.7%（6/29），差異無統計學意義（χ2= 0.39，P＞0.05）。結論 重慶地區結核分枝桿菌具有明顯的基因多態性，其主要流行基因型為北京家族，其中北京家族中主要為現代型；北京家族菌株、非北京家族菌株均與耐藥性無明顯相關性。

分枝桿菌，結核； 基因型； 抗藥性，細菌； 基因分型技術； 重慶市

據估計，世界人口有1/3感染過結核分枝桿菌。我國的結核病患者例數位居世界第二位，并且80%的結核病患者來自農村地區。重慶市是西部結核病疫情較重的地區，據統計，2008年登記的12萬例疑似結核病患者中，農村邊遠地區患者占70%以上。結核病不僅影響民眾的身體健康，同時也給社會帶來嚴重的經濟負擔［1］。

結核分枝桿菌基因分型有助于更好地理解結核病的流行規律。通過分型研究證實結核分枝桿菌具有明顯的基因多態性，并且不同的基因家族具有獨特的分子特征、地區性分布和致病性［2］。因此，對結核分枝桿菌臨床分離株進行分子分型鑒定不僅成為結核病分子流行病學研究的基礎，而且成為目前結核病研究的熱點之一。間隔區寡核苷酸分型（Spoligotyping）自20世紀90年代由Kamerbeek等設計用于結核分枝桿菌復合群基因分型以來，由于其具有操作簡便、快速，結果易數字處理，可重復性高，分型效果穩定，且具有較豐富的多態性，無需菌株培養等優點，在世界范圍內得到了廣泛應用［3］。

筆者對2011年1—12月從重慶市結核病患者分離培養到的113株結核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型研究，以了解重慶地區結核分枝桿菌的基因型和特征；了解北京家族在重慶的流行狀況；分析不同基因型，特別是北京家族與抗結核藥物耐藥性的關系。

材料和方法

一、標本來源及資料

113株結核分枝桿菌臨床分離株來源于2011 年1—12月重慶市結核病防治所分離的113例涂片陽性痰標本，其中男83例，女30例，年齡范圍14～82歲，平均年齡（61±14.57）歲，均為具有重慶戶籍的結核病患者。對菌株進行培養鑒定和藥物敏感性檢測。參照菌株采用標準菌株H37Rv，由中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室提供。

二、藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗采用比例法。培養基內藥物的終濃度分別為：異煙肼0.2μg/ml、利福平40μg/ml、乙胺丁醇2μg/ml、鏈霉素4μg/ml、氧氟沙星2μg/ml。對以上檢測的任何一種藥物耐藥的菌株為耐藥株。具體方法見文獻［4］。

三、DNA提取

收集經羅氏（L-J）培養基（珠海貝索生物技術有限公司）培養、生長良好菌體，取適量，80℃孵育30 min滅活，離心收集菌體，用400μl TE緩沖液懸菌，于沸水中煮沸30 min；離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心3 min，取上清即為DNA模板，—20℃保存備用。

四、分型方法

1.Spoligotyping分型：根據Kamerbeek等［5］建立的Spoligotyping標準化方法對113株結核分枝桿菌進行分型。通過引物DRa和DRb擴增結核分枝桿菌DR區。DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′，5′端進行生物素標記；DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。PCR反應條件：96℃3 min；96℃1 min，55℃1 min，72℃30 s，35個循環；延伸6 min。同時擴增結核分枝桿菌H37Rv和卡介苗（中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室提供）作為對照。將PCR產物與結合有43個間隔區寡核苷酸探針的Biodyne C膜（美國Pall公司）進行雜交。最后，通過鏈霉素親和素-過氧化物酶聯接體（streptavidin-peroxidase conjugate，華美生物工程公司）進行酶孵育及CDP-star（華美生物工程公司）檢測，X線曝光獲得結果。

2.NTF分型：通過引物（引物為NTF-L：5′-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3′；NTF-R，5′-TGCCGTTGTCGAAATCTAAACCC-3′。對Spoligotyping鑒定出的北京家族菌株在NTF區進行擴增，PCR反應條件：94℃5 min；94℃1 min，62℃1 min，72℃1.5 min，35個循環；72℃延伸10 min。

五、結果判定

1.Spoligotyping結果分析：對Spoligotyping 43個間隔區雜交結果指紋圖譜進行分析。其間隔區的存在用二進制表示，Spoligotyping結果通過國際數據庫MIRU-VNTRplus（http：//www.miruvntrplus.org）［6］進行比對，主要是與世界各地已知的結核分枝桿菌基因型分別比對，從而確定菌株基因家族和（或）基因型。用BioNumerics（version 5.0）軟件分析：將Spoligotyping結果進行軟件聚類，聚類主要根據平均連鎖聚類法進行，結果判定由圖可知特征相同或相近的菌株被分為同一型。

2.NTF結果分析：通過電泳結果，分析IS6110插入情況；古典型表現為302 bp，現代型表現為1500 bp。

六、統計學分析

使用SPSS 13.0統計學軟件對表型和基因型數據進行統計分析，基因型檢出率差異比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。應用logistic單因素回歸分析，對不同年齡、性別、基因型對不同菌株產生耐藥的情況進行統計分析。運用Pearson卡方檢驗，對北京家族現代型和古代型分離株產生耐藥情況的差異進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、菌株不同基因型的組成

菌株呈現多個基因型，如圖1所示，可分為2個基因群，即北京家族（Beijing family）［或稱北京基因型（Beijing genotype）］和非北京家族（non-Beijing family），分別為77株（68.1%）和36株（31.9%），共有27種基因型，其中19株為獨立類型，其余94株分為8簇，成簇率為83.2%（94/113）。非北京家族菌株表現為高度的基因多態性，可分為20個基因型，15株為獨立類型。

圖1 結核分枝桿菌Spoligotyping基因分型聚類分析圖

二、Spoligotyping不同分型的分布

如圖2所示，113株結核分枝桿菌臨床分離株以北京家族為主要基因型。非北京家族以 T家族為主要基因型，其中T1基因型為13株（36.1%，13/ 36）；T2基因型為3株（8.3%，3/36）；T3基因型為1株（2.8%，1/36）；T5基因型為3株（8.3%，3/36）；U基因型為2株（5.6%，2/36）；H3基因型為3株（8.3%，3/36）；LAM3&convergent基因型為1株（2.8%，1/36）；LAM4基因型為1株（2.8%，1/36）。另外，發現9株（25.0%，9/36）結核分枝桿菌菌株表現的9種基因型在國際數據庫中未檢索到，為新的基因型。

圖2 113株結核分枝桿菌的主要Spoligotyping家族和次要家族的流行分布

三、重慶市113株結核分枝桿菌臨床分離株與耐藥性相關分析

在本研究中，113株臨床分離株均獲得基因分型結果，并獲得完整的藥敏實驗結果。應用logistic單因素回歸分析，對不同年齡、性別、基因型對不同菌株產生耐藥的情況進行分析，結果顯示不同年齡、性別、基因型對菌株產生耐藥的情況差異均無統計學意義（表1）。

四、北京家族結核分枝桿菌與耐藥性相關分析

如表2所示，本研究將77株北京家族菌株分為現代型和古代型，分別為48株（62.3%，48/77）和29株（37.7%，29/77）。其中任意耐藥現代型菌株為13株（27.1%，13/48），任意耐藥古代型菌株為6株（20.7%，6/29）。經Pearson卡方分析，北京家族不同亞型的分離株發生耐藥的情況差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。

表1 不用因素對抗結核藥物的耐藥情況

表2 北京家族古代基因型和現代基因型對抗結核藥物的耐藥情況

討 論

北京家族是中國結核分枝桿菌的主要基因型。據報道，中國北方地區和南方地區北京家族表現為“北多南少”的特征：北方地區的北京家族達到76.5%，而南方地區的北京家族只有53.2%［7］。重慶位于中國的西南方，是結核病疫情高發區。此次研究中，筆者的研究結果顯示：重慶北京家族占全部菌株的68.1%（77/113），為重慶市主要流行基因型，與報道基本相符。通過NTF分型，將北京家族分為古代型與現代型。文獻報道，現代型結核分枝桿菌引起包括中國、俄羅斯、南非在內的世界范圍的流行［8-9］；而古代型在美國引起了小范圍的暴發［10］，在HIV/Mtb雙重感染患者中也檢測到古代型北京家族結核分枝桿菌［11］。本研究結果顯示，在77株北京家族菌株中古代型為29株（37.7%，29/77），現代型為48株（62.3%，48/77）。說明現代型北京家族結核分枝桿菌在重慶市北京家族結核分枝桿菌中占優勢地位，所以加強流行病學檢測和生物學特性研究是十分必要的。非北京家族占31.9%（36/113），其表現為高度的基因多態性，以T家族為主，其中T1基因型檢出率為36.1%（13/36）。文獻報道，T1、T2主要流行于非洲和中、南美洲地區［12］，因此，T1在重慶的高檢出率可能與該地區炎熱、潮濕的氣候因素有關，人口流動也可能是原因之一，另外，本研究發現了9種新基因型，將在后期工作中展開關于這部分新基因型的分子進化的研究。本研究結果基本探明了重慶市結核分枝桿菌基因型的特點，為重慶市結核病病原學和結核病控制提供一定的科學依據。

另外，結核病的耐藥問題是目前結核病防治的重要研究課題，由于耐多藥北京家族菌株多次引起暴發性流行，使得北京家族菌株與耐藥之間的關系成為了研究的熱點［13］，但研究結果不盡相同。有些文獻報道，北京家族菌株耐藥率高于非北京家族，如越南胡志明市、愛沙尼亞、美國紐約等地區［14］。也有文獻報道，北京家族菌株與非北京家族菌株耐藥率差異無統計學意義，如印度尼西亞、阿塞拜疆、哥倫比亞等地區，而香港地區北京家族菌株的耐異煙肼菌株比率甚至低于非北京家族菌株［15-16］。筆者的研究結果顯示：77株北京家族耐藥率為24.7% （19/77），36株非北京家族耐藥率為38.9%（14/36），差異無統計學意義（χ2=2.40，P＞0.05）。說明不支持北京家族菌株更易產生耐藥的推斷，即不認為結核分枝桿菌北京家族與耐藥性之間存在相關性。現代型北京家族耐藥率為27.1%（13/48）；古代型北京家族耐藥率為20.7%（6/29），差異無統計學意義（χ2=0.39，P＞0.05）。筆者推測現代型、古代型北京家族與耐藥性之間不存在相關性。采用寡核苷酸方法分辨出的基因型與耐藥率差異無統計學意義，一方面也可能是由于樣本量較??；另一方面寡核苷酸分辨能力有限，筆者將在后續實驗中擴大樣本量，采用多種其他基因分型方法補充完整。

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Genotyping and drug resistance analysis of M.tuberculosis clinical isolates in Chongqing

WANG Xiao-yan*，ZHAO Yan-lin，PANG Yu，WANG Yu-feng，WAN Kang-lin，LIUJie，LIU Ying，SHENJing，DUChang-ting，ZHANG Shun.*Reference Laboratory，Chongqing Institution of Tuberculosis Control and Prevention，Chongqing 400050，China

ZHANG Shun，Email：ZS52077@sina.com

Objective To study the prevalence of different genotypes of M.tuberculosis in Chongqing and analyze the relationships between genotype and drug-resistant phenotype.Methods One hundred and thirteen M. tuberculosis clinical isolates were collected in Chongqing from January to December in 2011，performed drug susceptibility testing by the proportion method，analyzed the genotypes by Spoligotyping and PCR method，and then made gene glustering analysis.Results One hundred and thirteen clinical strains were divided into 2 gene clusters，namely Beijing family（68.1%，77/113）and non-Beijing family（31.9%，36/113）.Of 77 Beijing family strains，48 （62.3%）strains were belong to modern type，29（37.7%）were the ancient type.Of 36 strains with non-Beijing family，13（36.1%）strains were T1 type，and found 9 new genotypes.The drug-resistant rate of Beijing family strains was 24.7%（19/77），and of non-Beijing family strains was 38.9%（14/36），in which there was no significant differences（χ2=2.40，P＞0.05）.The drug-resistant rate of modern type strains in Beijing family was 27.1% （13/48），and of the ancient type strains was 20.7%（6/29），in which there was no significant differences（χ2= 0.39，P＞0.05）.Conclusion There was obvious gene polymorphism in M.tuberculosis isolates in Chongqing. Beijing family was the main epidemic strains，in which the modern type was predominant.There was no significant correlation between genotype and drug resistance.

Mycobacterium tuberculosis； Genotype； Drug resistance，bacterial； Genotyping techniques；Chongqing city

2013-07-22）

（本文編輯：郭萌）

400050重慶市結核病防治所參比實驗室（汪曉艷、劉潔、劉英、沈靜、杜昌廷、張舜）；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心 國家結核病參比實驗室（趙雁林、逄宇、王玉峰）；中國疾病預防控制中心傳染病所（萬康林）

張舜，Email：ZS52077@sina.com