星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化脂溶性丹參提取物速釋滴丸處方工藝

符少蓮， 馮翠娟， 李 沙

(暨南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，廣東廣州510632)

丹參為唇形科多年生草本植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。性微寒，味苦，具有活血調(diào)經(jīng)，涼血消癰，清心安神的功效［1］。丹參酮是丹參中具有橙黃色和橙紅色特征的脂溶性有效成分，大量研究表明丹參酮在抗腫瘤、心腦血管疾病、抗菌消炎等方面均有良好的治療作用［2-4］，但丹參酮在水中的溶解度極小，口服給藥生物利用度低，從而影響了其藥效作用的發(fā)揮［5-6］。為改善其溶出，已有研究報(bào)道將其制成固體分散體、環(huán)糊精包合物等［7-8］，均能有效提高其溶出度。但這些研究均以純度很高的丹參酮ⅡA為研究對象，而工業(yè)生產(chǎn)中目前主要使用的原料是丹參提取物。為此本研究采用丹參提取物作為研究對象制備滴丸，以提高丹參脂溶性成分的溶出性能。

采用適宜的水溶性基質(zhì)將難溶性藥物制成滴丸，可有效地提高其溶出性能，且滴丸因具有操作簡便，生產(chǎn)周期短，劑量準(zhǔn)確，便于貯存和服用的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛研究［9］。丹參酮ⅡA是丹參中脂溶性成分的代表［10］，本實(shí)驗(yàn)在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以丹參酮ⅡA作為代表性成分，測定其累積溶出百分率作為評價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化處方，研制速釋型脂溶性丹參提取物滴丸，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)與臨床用藥需求。

1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (鞏義市英峪予華儀器廠);RCZ-8A智能藥物溶出儀 (天津大學(xué)精密儀器廠);高效液相色譜儀 (島津公司LC-10A);滴丸機(jī) (廣東正洪公司)。

脂溶性丹參提取物 (丹參酮ⅡA純度40%，廣州美晨藥業(yè)有限公司，丹參酮ⅡA純度47%，批號080906);丹參酮ⅡA對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號2006019);聚乙二醇 (PEG)2000(廣東光華化學(xué)廠有限公司，20100918);聚乙二醇4000(廣東光華化學(xué)廠有限公司，20100413);十二烷基硫酸鈉 (SDS，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，1098983);甲醇 (色譜純)。

其他試劑和試藥均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 滴丸的制備 稱取適量PEG 2000與PEG4000于60℃水浴中熔融，加入脂溶性丹參提取物，攪拌一定時(shí)間，使其均勻分散，最后將藥液滴入液體石蠟冷卻液中冷凝成丸，待滴丸完全冷卻后，取出滴丸，去除表面附著的液體石蠟，放入真空干燥箱中干燥12 h即得。

2.2 體外溶出試驗(yàn) 參照《中國藥典》2010年版二部溶出度測定法第一法進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)，以1%SDS(十二烷基磺酸鈉)水溶液為溶出介質(zhì)，溫度(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速100 r/min進(jìn)行試驗(yàn)，于5、10、20、30、45、60 min分別取樣2 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，同時(shí)補(bǔ)加等量同溫溶出介質(zhì)。取續(xù)濾液采用HPLC方法測定其中丹參酮ⅡA的量，并計(jì)算累積溶出百分率，作為處方優(yōu)化的評價(jià)指標(biāo)。

2.3 丹參酮ⅡA測定方法的建立 采用HPLC法建立丹參酮ⅡA的測定方法。

2.3.1 色譜條件 漢邦Hedera C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相為甲醇－水 (85∶15);檢測波長為270 nm;體積流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為 20 μL。

2.3.2 溶液的制備 (1)對照品溶液:取丹參酮ⅡA對照品約10 mg，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液，再根據(jù)需要用甲醇稀釋成相應(yīng)濃度。 (2)脂溶性丹參提取物溶液:精密稱取脂溶性丹參提取物適量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得。(3)供試品溶液:取制得的滴丸，研細(xì)，取約0.02 g，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇15 mL超聲20 min，再加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。(4)陰性對照液:取對應(yīng)量的空白載體材料，精密稱定，按供試品溶液項(xiàng)下操作，制成陰性對照品溶液。(5)脂溶性丹參提取物溶出液:精密稱取脂溶性丹參提取物適量，進(jìn)行溶出試驗(yàn)，于60 min取樣2 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。(6)滴丸溶出液:取某一代表性處方制備的滴丸，進(jìn)行溶出試驗(yàn)，于60 min取樣2 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。(7)溶出試驗(yàn)陰性對照液:取對應(yīng)量的空白載體材料，精密稱定，進(jìn)行溶出試驗(yàn)，于60 min取樣2 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 專屬性考察 按2.3.1項(xiàng)色譜條件，分別取丹參酮ⅡA對照品溶液 (40 mg/L)、脂溶性丹參提取物溶液 (含丹參酮ⅡA40 mg/L)、供試品溶液 (含丹參酮ⅡA 40 mg/L)、陰性對照液、脂溶性丹參提取物溶出液、滴丸溶出液、溶出試驗(yàn)陰性對照液各 20 μL進(jìn)樣，記錄 HPLC圖譜 (圖 1、2)。提取物中丹參酮ⅡA在所用色譜條件下，分離度好，峰形對稱穩(wěn)定，保留時(shí)間約為9.7 min。載體材料與溶出介質(zhì)在丹參酮ⅡA色譜峰處無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

圖2 溶出樣品高效液相色譜圖Fig.2 Typical HPLC chromatograms of drug dissolution samples

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取適量2.3.2項(xiàng)下的對照品貯備液，用甲醇稀釋成0.2、0.5、1、5、10、20、40、80 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果在0.2～80 mg/L內(nèi)，峰面積 (A)與藥物濃度 (C)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=126831C+4968.1，r=0.9999。

2.3.5 日內(nèi)與日間精密度試驗(yàn) 精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液 (40 mg/L)20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD為日內(nèi)精密度;精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液 (40 mg/L)20 μL，連續(xù)進(jìn)樣3次，連續(xù)5 d，記錄峰面積，計(jì)算RSD為日間精密度。測得日內(nèi)精密度為1.11%，日間精密度為0.53%，表明方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 配制3份供試品溶液和3份具代表性的滴丸溶出樣品，置于室溫，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積及計(jì)算RSD。供試品溶液RSD分別為1.42%、1.92%、1.89%，滴丸溶出樣品 RSD分別為0.75%、1.56%、1.42%，說明待測樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備六份供試品溶液，分別取20 μL進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)三針，按外標(biāo)一點(diǎn)法用峰面積計(jì)算樣品中丹參酮ⅡA的含量，計(jì)算平均值與RSD。測得丹參滴丸中丹參酮ⅡA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 (47±0.6)mg/g，RSD為1.31%，說明方法的重復(fù)性好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取制得的滴丸，研細(xì)，取約8.5 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，共9份，3份一組，分別精密加入相當(dāng)于樣品處方中丹參酮ⅡA量的80%、100%、120%的對照品溶液，按2.3.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣20 μL測定峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算丹參酮ⅡA的量，求得高、中、低3個(gè)加樣量下的平均回收率分別為100.68%、101.46%、101.67%，表明樣品回收率符合要求。

2.4 單因素考察與結(jié)果 按2.1項(xiàng)法制備滴丸，選取兩種載體比例、藥物與載體比例、攪拌時(shí)間作為考察因素，以累積溶出百分率為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)評價(jià)各處方工藝因素對滴丸溶出性能的影響。具體因素水平分別為:PEG 2000∶PEG4000(1∶9、3∶7、5∶5、7∶3)、藥物∶載體 (1∶11、1∶9、1∶7、1∶5)、攪拌時(shí)間 (1、2、3 h)。結(jié)果見圖3。

由圖3結(jié)果可知，以PEG 2000與PEG 4000作為載體材料制備滴丸能有效提高脂溶性丹參提取物的溶出效果，利用SPSS軟件對各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出數(shù)據(jù)分別進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，兩種載體比例、藥物與載體比例這兩個(gè)因素對各時(shí)間點(diǎn)溶出結(jié)果的影響有顯著差異 (P＜0.05)，攪拌時(shí)間對各時(shí)間點(diǎn)溶出結(jié)果則沒有顯著影響 (P＞0.05)。單因素考察結(jié)果顯示PEG 2000∶PEG 4000為3∶7、藥載比為1∶9時(shí)，丹參酮ⅡA釋放最快最完全。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與處方優(yōu)化

2.5.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定PEG 2000與PEG 4000的比例、藥物與載體比例作為考察因素，以累積溶出百分率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行2因素、5水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)。根據(jù)2.4項(xiàng)的單因素考察結(jié)果選取兩因素的極大值和極小值水平，各因素水平代碼值和實(shí)際操作物理量值見表1。按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理安排13次試驗(yàn)，各試驗(yàn)的溶出結(jié)果見表2。

圖3 處方工藝因素對滴丸溶出效果的影響 (n=3)Fig.3 Effect of the formulation and process factors on the dissolution behaviour of dropping pills(n=3)

表1 各因素各水平的代碼值及實(shí)際數(shù)值Tab.1 Factors and levels in code and actual values

2.5.2 數(shù)據(jù)分析 以載體比例和藥載比為自變量，累積溶出百分率的“總評歸一值”為因變量，采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式回歸，并以擬合優(yōu)度 (r)和置信度 (P)作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及溶出試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of dissolution test

多元線性模型公式為R=X0+X1A+X2B，二次多項(xiàng)式模型公式為R=X0+X1A+X2B+X3AB+X4A2+X5B2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合得到的多元線性方程為R=1.509+1.412A– 13.044B(P=0.029，r=0.713)，二次多項(xiàng)式模型方程為:R=－5.189+3.668A+118.581B+42.5AB－10.844A2－721.875B2(P=0.003，r=0.946)，兩種模型均P＜0.05，但線性模型方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)r太低，預(yù)測性相對較差，因此選擇二次多項(xiàng)式模型進(jìn)行處方優(yōu)化，其擬合參數(shù)值見表3。

表3 二次多項(xiàng)式模型方程中各項(xiàng)的擬合參數(shù)值及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Values of fitting parameters in quadratic polynomial model equation and statistical test

2.5.3 效應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)擬合方程，通過Design Expert 7.0軟件繪制評價(jià)指標(biāo)OD值隨因素變化的效應(yīng)面圖和等高線圖 (圖4、圖5)。

圖4 等高線圖Fig.4 Contour map

圖5 效應(yīng)面圖Fig.5 The response surface graph

圖4、圖5顯示，隨著PEG 2000量的不斷升高，溶出呈增加趨勢，但過高會使溶出減少;隨著丹參提取物量的減少，溶出效應(yīng)升高。從效應(yīng)面圖和等高線圖可知，當(dāng)A的取值范圍在0.26～0.40，B的取值范圍在0.09～0.10之間時(shí)，OD值落在最高效應(yīng)值區(qū)間，即溶出效果最佳，因此確定兩個(gè)因素的最佳取值范圍在此區(qū)間。進(jìn)一步通過Design Expert 7.0軟件預(yù)測分析，獲得一組OD響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件:A為0.35，B為0.09，在此優(yōu)化條件下，因變量OD值的預(yù)測值為0.93。

2.5.4 優(yōu)化處方驗(yàn)證 按上述預(yù)測的優(yōu)化處方制備3批樣品，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4。3批樣品的OD實(shí)測值與預(yù)測值間的偏差均小于5%，表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法預(yù)測性良好。按照單因素實(shí)驗(yàn)獲得的最佳條件 (A=0.3，B=0.1)所制備的滴丸，測得OD值均值為0.85(n=3)。經(jīng)t檢驗(yàn)得到，效應(yīng)面法獲得的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件顯著優(yōu)于單因素實(shí)驗(yàn)法 (P＜0.01)。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Validation of the optimized formulation obtained by central composite design-response surface methodology

3 討論

丹參酮是丹參中含有的脂溶性活性成分，在水中的溶解度小，口服給藥生物利用度低。為改善其溶出，本研究采用固體分散技術(shù)，將脂溶性丹參提取物制成滴丸。結(jié)合藥典，選取其中最主要的脂溶性成分丹參酮ⅡA(其量約為藥材的0.11% ～0.19%)［11］作為代表性測定成分，評價(jià)滴丸對丹參脂溶性成分溶出性能的改善作用。圖2溶出液的色譜圖顯示，制成滴丸后，不但丹參酮ⅡA的溶出明顯增加，在相同的時(shí)間點(diǎn)下，提取物中其它各成分的峰面積在滴丸組中也均有不同程度的增高，說明本研究所制備的滴丸可提高丹參提取物中各種脂溶性成分的整體溶出性能，達(dá)到了預(yù)期目的。

以PEG 2000和PEG 4000作為載體材料制備的脂溶性丹參提取物滴丸中，丹參酮ⅡA的溶出得到極顯著的提高 (P＜0.01)，在20 min中時(shí)已達(dá)到53%，約為提取物原料的2倍。目前上市的丹參速釋制劑有復(fù)方丹參滴丸，但其所含的有效成分主要為丹參的水溶性成分，如丹參素，尚無丹參脂溶性成分的速釋制劑上市。本研究使用工業(yè)化生產(chǎn)常用的脂溶性丹參提取物作為原料藥制備滴丸，較單體成分的同類研究成本低，更適合臨床用藥需求，其后期進(jìn)一步的研發(fā)具有較高的可操作性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

在采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行初步處方工藝優(yōu)化時(shí)，溶出度隨著PEG 2000用量的增大有增高的趨勢，在PEG 2000與PEG 4000比例為3∶7時(shí)溶出度最高，加入過多的PEG 2000不易滴制成丸，因此兩者比例選在3∶7附近較為合適。固定載體比例，丹參酮ⅡA的溶出度隨著藥載比的降低而增加，但當(dāng)藥載比降低到1∶11時(shí)，溶出卻比1∶9時(shí)有所減少。這可能是因?yàn)檩d體量越來越高時(shí)，載體在溶出過程中易形成集中層，圍繞于藥物顆粒周圍，因而影響了藥物在溶出介質(zhì)中的溶出［12］，因此藥載比選在1∶9周圍較為合適。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國內(nèi)外近年來常用于優(yōu)化藥材提取工藝與制劑處方工藝篩選的方法，簡便、直觀，且在模型建立上采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)合相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測值更接近真實(shí)值［13-15］。與正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)相比，星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得的信息量更大，采用效應(yīng)面法分析更直觀，精密度更高，預(yù)測性更好。本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用2因素5水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化了脂溶性丹參提取物滴丸的處方，與正交試驗(yàn)常用的3水平相比，增加了考察水平，可使優(yōu)化結(jié)果更具可預(yù)測性、準(zhǔn)確性。星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，兩種載體的比例、藥物與載體比例對丹參提取物滴丸的溶出性能有顯著影響，通過效應(yīng)面法預(yù)測的優(yōu)化處方的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其函數(shù)預(yù)測值之間的偏差小于5%，表明此法擬合的數(shù)學(xué)模型方程對因素水平的優(yōu)化預(yù)測性高。

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