滾環擴增陽離子共軛聚合物均相檢測microRNA

成永強，賈海蓮，唐志遠，趙晶晶，李正平

（河北大學 化學與環境科學學院，藥物化學與分子診斷省部共建教育部重點實驗室，河北 保定 071002）

microRNA（miRNA）是細胞內源性非蛋白編碼的小分子RNA（19～24個堿基）［1］，其表達水平與人類重大疾病密切相關［2］.miRNA 現已成為一種新的生物標記物應用于癌癥等重大疾病的早期診斷和治療［3］.例如，研究發現miR221在結腸癌、人腦膠質母細胞瘤等多種細胞中過表達，因此，miR221分析對與其相關疾病的診斷和治療具有重要意義［4］.但是，由于miRNA 分子小、含量低，許多同源miRNA 序列相似度高，僅差1～2個堿基，因此，高靈敏度的miRNA 檢測一般需要特異、高效的擴增技術［5］.

滾環擴增（rolling circle amlification，RCA）是近年來出現的一種高效的擴增技術，它以寡聚核苷酸為引物，以單鏈環狀DNA，即鎖式探針（Padlock Probe，PLP）為模板，在具有頂替作用DNA 聚合酶的作用下實現DNA 的高效擴增，生成包含若干質量復序列的DNA 長鏈產物［6］.RCA 技術應用于miRNA 檢測具有顯著的優點：恒溫擴增，不需要熱循環；特異性好，小分子miRNA 正好可以作為環形DNA 探針成環的模板，并且所用的酶連接反應可精確識別單堿基錯配；擴增產物為上百個串聯重復序列的長鏈DNA，能同時結合幾百個特異標記探針，檢測信號集中［7］.但是，利用標記探針檢測經常需要固相的分析模式，需要多步雜交和洗滌，步驟繁瑣.當前，RCA 均相檢測miRNA 多采用熒光染料與DNA 產物相結合并產生強熒光進行檢測［8］.但由于熒光染料與溶液中的DNA 和RNA 都能結合，在實際樣品分析時易使檢測的背景值偏高.

本文中，為了降低RCA 反應均相檢測miRNA 的背景值，提高檢測的靈敏度，同時克服標記探針固相分析的不足，筆者首先使熒光標記探針與長鏈DNA 產物雜交，然后，加入陽離子共軛聚合物（catiomic conjugated polymer，CCP），其與DNA 產物可通過靜電力作用結合，同時與雜交的熒光標記探針發生高效的熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy ransfer，FRET）［9］；未雜交的單鏈熒光標記探針應用Exo I水解成單核苷酸，其與CCP相互作用力弱，不能發生有效的FRET，無需分離和洗滌步驟，可實現RCA 擴增miRNA 的均相、特異檢測.方法與非特異熒光染料相比，可有效降低均相檢測miRNA 的背景值.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

F4500熒光分光光度計（Hitachi，日本）；2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems，USA）；Phi29 DNA 聚合酶、ExoΙ（Epicenter Biotechnologies，USA）；T4RNA ligase2（New England Biolabs，USA）；實驗選用miR221作為研究的目標miRNA，所有合成的寡聚核苷酸引物及miR221序列（表1）、脫氧核苷三磷酸的混合物（dNTPs）、Ribonuclease Inhibitor和焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水購自大連寶生物科技有限公司（Takara，Dalian）；4－（2－hydroxyethyl）－1－piperazineethanesulfonic acid（HEPES）購自Sigma.所用陽離子共軛聚合物（CCP）為poly［（9，9－bis（6－N，N，N－trimethylammonium）hexyl）fluorenylenephenylenedibromide］（PFP）購自常州欣宏科生物化學有限公司.實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為DEPC處理過的超純滅菌水.

表1 實驗所用寡聚核苷酸引物及miRNA序列（5′－3′）Tab.1 Sequences of probes and miRNA used in the experiments（5′－3′）

1.2 實驗方法

1.2.1 鎖式探針的連接成環反應

在200μL的PCR 管中加入0.5μL 的10×T4RNA Ligase2緩沖溶液，其中含有500mmol／L Tris－HCl，pH 為7.5，20mmol／L的MgCl2，10mmol／L 的二硫蘇糖醇（DTT），4mmol／L 的ATP.再加入1μL的200nmol／L的PLP 探針溶液，0.5μL的40U／L Ribonuclease Inhibitor，適量的miR221溶液，加DEPC處理水至6μL，加熱到55℃保存3min.然后在37℃保持20min.加入3U 的T4RNA Ligase2，0.5μL的10×T4RNA Ligase2緩沖溶液和DEPC處理水至終體積為10μL，于37 ℃連接成環50min.反應完后，在溶液中加入40U 的ExoⅠ，于37 ℃保持60min，在80 ℃溫育15min，以失活ExoⅠ.

1.2.2 RCA 反 應

在連接反應溶液中，加入10μL 的Phi29DNA 聚合酶反應溶液，其中包括：200mmol／L 的Tris－HCl，250mmol／L的KCl，50mmol／L 的MgCl2，25mmol／L 的（NH4）2SO4，20mmol／L 的DTT，1.25mmol／L的dNTPs，30U 的phi29DNA 聚合酶，在30 ℃下進行RCA 反應4h，于75 ℃溫育5min，失活phi29DNA聚合酶.

1.2.3 RCA 產物的熒光檢測

取RCA 產物9μL，加入2μL的2μmol／L熒光標記DNA 探針，混勻后在70 ℃下保持3min，于37 ℃雜交45min.反應完后加入20U 的ExoΙ，在37 ℃保持60min，80 ℃溫育15min，失活ExoⅠ.

在500μL的離心管內加入194μL 的HEPES溶液（25mmol／L，pH＝7.8），4μL 的雜交產物和2μL的15μmol／L PFP溶液，總體積為200μL.應用F－4500熒光分光光度計在激發波長為380nm，掃描波長為400～600nm 下進行測量.

2 結果與討論

2.1 RCA 反應均相檢測miRNA 原理

利用滾環擴增反應結合陽離子共軛聚合物熒光共振能量轉移均相檢測miRNA 的原理如圖1所示.設計的PLP探針首先以目標miRNA 分子（miR221）為模板，在T4RNA ligase2的作用下連接成環.T4RNA ligase2在以miRNA 為模板連接DNA 探針時具有很好的特異性［7］，而且能高效地催化連接3′端有2 個RNA 堿基修飾5′端磷酸化修飾的DNA 引物［10］.因此，為了提高連接效率，設計PLP 探針的3′端有2 個RNA 堿基修飾.未成環的線性PLP探針用ExoΙ降解，以防止其影響后面的RCA 和標記探針的雜交反應.當加入Phi29DNA 聚合酶反應溶液，miRNA 分子可直接作為引物引發RCA 反應，生成具有上百重復序列的長鏈DNA 產物.然后，在RCA 產物溶液加入與長鏈DNA 產物序列互補的熒光素標記探針，使其充分雜交.而溶液中未雜交的過量熒光素標記探針利用ExoΙ降解成單核苷酸分子.當在產物溶液中加入陽離子共軛聚合物（PFP）時，由于其陽離子骨架可與核酸分子通過強靜電力結合，并且長鏈的共軛分子結構具有特殊的光學和電化學性能，具有優良的光捕獲性質和信號放大能力［11］，PFP 與熒光標記的DNA 產物通過靜電力作用相結合，能發生強烈的熒光共振能量轉移（FRET）.而被降解的熒光素標記單核苷酸分子電荷小，其與PFP作用較弱，距離較遠，二者之間不能發生有效的FRET.因此，根據FRET 效率的大小可以實現RCA 擴增miRNA 的均相檢測.

圖1 RCA反應陽離子共軛聚合物均相檢測miRNA原理Fig.1 Principle of homogeneous detection of miRNA by RCA and CCP

圖2為miRNA（miR221）樣品與空白溶液經RCA 反應后應用PFP檢測的熒光光譜圖.從圖2曲線a可見，目標miR221分子的反應產物的熒光光譜在PFP的熒光峰（λem＝420nm）處降低.同時，熒光素分子的熒光發射峰（λem＝525nm）顯著增強，表明發生了PFP到熒光素分子的能量轉移.目標miR221可使PLP成環并引發RCA 反應，產生的DNA 長鏈上雜交了多個熒光素標記的DNA 探針.在加入PFP 后，其能與DNA分子通過靜電力作用相互吸引，PFP作為能量供體把能量轉移到DNA 上標記的熒光素分子上，產生高效的FRET.而在空白溶液中（曲線b），在525nm 熒光素的熒光強度很低，同時420nm 處PFP的熒光值高于樣品的熒光值，其FRET 效率（I525nm／I420nm）顯著比miR221產生的低.這是由于在空白溶液中，不能發生連接成環反應，亦不能引發RCA 反應.單鏈熒光素標記探針被ExoΙ消化降解為單核苷酸小分子，其電荷小，與PFP的結合能力弱，不能產生有效的FRET.據此，筆者優化了反應實驗條件，建立了RCA 擴增均相檢測miRNA 的新方法.

圖2 miRNA的RCA反應產物應用PFP檢測的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra from solution containing PFP and RCA products from miRNA

2.2 熒光標記探針濃度對實驗結果的影響

實驗過程中，鎖式探針濃度和PFP的用量等反應條件對結果影響較小.而熒光標記探針的濃度對實驗結果的影響較大，需進行優化.

圖3 熒光標記探針的濃度對實驗結果的影響Fig.3 Effect of concentration of fluorescein－labeled probe on the experimental results

熒光標記探針的用量對PFP引起的FRET 效率（I525nm／I420nm）有著較大影響，實驗優化了不同用量熒光標記探針對FRET 效率的影響.圖3為熒光標記探針的濃度分別為105，200，364，500nmol／L 時，空白和樣品的FRET 效率情況.如圖3所示，miRNA 的反應產物的FRET 效率隨熒光標記探針濃度升高而顯著提高.當超過364nmol／L時，FRET 效率提高并不明顯，表明熒光標記探針濃度為364nmol／L 時，其與RCA產物進行充分雜交，FRET 效率最大；而加入濃度再增加時，過量的標記探針會被ExoΙ降解消化掉，FRET效率幾乎保持不變.因此，實驗選擇364nmol／L為最佳熒光標記探針用量.

2.3 方法的校準曲線和靈敏度

在最佳熒光標記探針用量，RCA 反應4h的實驗條件下，測量了不同濃度miR221的熒光共振能量轉移效率.如圖4所示，miR221的濃度在0.5～100pmol／L 內，反應產物的相對FRET 效率隨其濃度的增加而增強.并且，相對FRET 效率與miR221濃度在0.5～20pmol／L內呈良好的線性關系（圖4插圖）.線性方程為Y＝1.928＋2.513cmiR221（pmol／L），Y 為相對FRET 效率.相關系數R＝0.997 8，檢出限（3σ，n＝11）為0.2pmol／L.對10pmol／L的miR221重復測定5次，其相對標準偏差為5.4%.

圖4 相對FRET效率與目標miR221不同濃度的關系Fig.4 Relationship between the relative FRET efficiency and the concentration of target miR221

3 結論

提出了一種利用滾環擴增結合陽離子共軛聚合物的熒光共振能量轉移技術均相檢測miRNA 的新方法.方法針對通常標記探針必須用固相檢測方式的不足，在熒光標記探針與RCA 產物雜交后，使用單鏈特異核酸外切酶I降解過量的熒光標記探針.然后，利用陽離子共軛聚合物PFP與熒光標記探針產生熒光共振能量轉移，實現了RCA 反應標記探針的均相檢測.同時，基于PFP 獨特的光學特性，可進一步提高目標miRNA 檢測的靈敏度.方法簡便，背景低，靈敏度高，不需要繁瑣的分離和精確的控溫步驟.方法可為miRNA 及DNA 等的均相RCA 檢測和原位成像分析以及臨床診斷提供一種新策略.

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