微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合模塊的設(shè)計(jì)研究

（韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005）

微生物學(xué)是本科生物技術(shù)和生物科學(xué)專業(yè)重要的專業(yè)基礎(chǔ)主干課程之一，該課程的理論性和實(shí)踐性均較強(qiáng).為了加深學(xué)生對(duì)理論知識(shí)和操作技能的理解和掌握，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)顯得尤為重要.目前，韶關(guān)學(xué)院的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)主要采用傳統(tǒng)的教學(xué)模式，即每次實(shí)驗(yàn)課均為獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)之間缺乏聯(lián)系性和系統(tǒng)性；授課過(guò)程中，指導(dǎo)教師將實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)原理、操作步驟和注意事項(xiàng)等內(nèi)容按部就班地灌輸給學(xué)生，學(xué)生利用已準(zhǔn)備好的器材，按照指導(dǎo)教師安排的實(shí)驗(yàn)流程和操作步驟一成不變的完成；最后學(xué)生抄寫(xiě)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)上的內(nèi)容和自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告.采用這種教學(xué)模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)，學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性不高，基本是以應(yīng)付教師的心態(tài)來(lái)完成實(shí)驗(yàn)；并且學(xué)生不能系統(tǒng)和完整地掌握微生物學(xué)的基本理論知識(shí)和操作技能.因此，近年來(lái)，筆者和教研室同仁們針對(duì)性地對(duì)各個(gè)年級(jí)的部分班級(jí)開(kāi)展綜合性實(shí)驗(yàn)的改革和嘗試，為提高地方院校應(yīng)用型人才的培養(yǎng)質(zhì)量方面進(jìn)行積極探索，并為打造校級(jí)《微生物學(xué)》精品課程奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).現(xiàn)將本教研室開(kāi)展的微生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的具體內(nèi)容和安排介紹如下.

1 綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)K的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組成和安排

1.1 玻璃器皿的清洗、包扎，培養(yǎng)基的配制及滅菌

在實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生首先要學(xué)習(xí)清洗微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用玻璃器皿的方法，如使用過(guò)或者未使用的培養(yǎng)皿、試管、三角瓶和移液管，并且學(xué)會(huì)對(duì)這些玻璃器皿的常規(guī)包扎方法.試管棉塞的制作等.在實(shí)驗(yàn)中需要配制多種的培養(yǎng)基［1］（具體見(jiàn)表1）、分裝、滅菌和無(wú)菌檢測(cè)，以備后面的實(shí)驗(yàn)使用.由于配制培養(yǎng)基種類較多，因此采用學(xué)生分組配制不同培養(yǎng)基的教學(xué)方式，但是要求不同組別之間的同學(xué)相互交流.通過(guò)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施，可以提高學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)的重視程度和學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的積極性，由于實(shí)驗(yàn)失敗會(huì)導(dǎo)致后面一系列實(shí)驗(yàn)均不能順利的實(shí)施完成，可以使學(xué)生體會(huì)到器皿的清洗包扎、配制培養(yǎng)基的重要性.

表1 論各種培養(yǎng)基的名稱、配方和目的

1.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選、純化及保藏

實(shí)驗(yàn)課前，要求學(xué)生到學(xué)校附近有機(jī)質(zhì)較多地方采集土壤樣品；為了確保實(shí)驗(yàn)的成功，安排部分學(xué)生采集屠宰場(chǎng)下水道附近的土壤樣品.采集土壤時(shí)，應(yīng)采集耕作層的土壤樣品，并且利用已滅菌的三角瓶收集.將采集的土樣進(jìn)行不同程度的稀釋，然后采用混菌法或涂布法將稀釋液添加到牛奶培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h后，觀察牛奶培養(yǎng)基平板上菌落的生長(zhǎng)狀況、以及菌體周?chē)馊Φ拇笮。髮W(xué)生挑取1～2個(gè)產(chǎn)生水解圈最大的菌株.由于挑選的菌落不一定是單菌落，因此要求學(xué)生將挑取的菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上劃“Z”型線分離，37℃培養(yǎng)18～24 h后，挑取菌落，直至挑到單菌落為止.挑取的單菌落采用兩種方式進(jìn)行保藏：（一）接種單菌落于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后于4℃斜面保藏.（二）接種單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，添加滅菌甘油制備凍存管后于-20℃或-70℃保藏.該實(shí)驗(yàn)的教學(xué)改變了常規(guī)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中目的性不強(qiáng)的土壤中微生物的分離實(shí)驗(yàn)，并且學(xué)生也進(jìn)一步掌握了對(duì)微生物菌株的保藏方法.在對(duì)產(chǎn)生蛋白酶菌株的純化過(guò)程中，可能部分學(xué)生需要多次的實(shí)驗(yàn)才能得到單菌落，這使學(xué)生知道科學(xué)研究不是一蹴而就，需要研究者的耐性和恒心.

1.3 產(chǎn)蛋白酶菌的革蘭氏染色及鏡檢

安排學(xué)生將分離獲得的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察菌株的革蘭氏類型、菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)（桿狀、球狀或者螺旋狀）、產(chǎn)生芽孢情況以及菌體大小等方面.為了確保學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，在實(shí)驗(yàn)中，指導(dǎo)教師示范操作革蘭氏染色的過(guò)程，并且提供典型的革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的染色結(jié)果，這有利于學(xué)生的感性認(rèn)識(shí).要求學(xué)生對(duì)分離獲得菌株染色時(shí)，在載玻片上必須對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌同時(shí)染色，只有這兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株獲得正確的染色結(jié)果后，才能根據(jù)分離獲得的未知菌株的染色結(jié)果判斷其革蘭氏類型.傳統(tǒng)的教學(xué)中以革蘭氏染色標(biāo)準(zhǔn)菌株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)之前就知道實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此缺乏對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣；而通過(guò)這種方式促使學(xué)生具有對(duì)自己分離菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)和革蘭氏染色類型等方面具有好奇心，這可提高學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣.在本次實(shí)驗(yàn)之中，由于后面的鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，因此這要求學(xué)生必須認(rèn)真操作，這也加強(qiáng)了學(xué)生的責(zé)任心.

1.4 產(chǎn)蛋白酶菌的PCR鑒定

目前分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，測(cè)定細(xì)菌的16S rDNA序列是鑒定微生物分類地位的關(guān)鍵依據(jù)，也是常用的鑒定手段.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握了對(duì)細(xì)菌基因組的提取制備，然后以基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的內(nèi)容讓學(xué)生初步掌握分子生物學(xué)技術(shù)在微生物上的應(yīng)用.安排學(xué)生在實(shí)驗(yàn)前一天，接種菌株到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)課中離心收集菌體，隨后提取菌體基因組DNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng).對(duì)于 16S rDNA PCR 擴(kuò)增采用的引物是：上游引物(27F)：5’-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物(1492R)：5-TACCTTGTTACGACTT-3’［2］；PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 3 min，然后進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)程序?yàn)?4℃變性30 s，50℃退火60 s，72℃延伸 2 min，最后72℃延伸 5 min，擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物大小約為1.5 kb；然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，送至測(cè)序公司測(cè)序.由于傳統(tǒng)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中未開(kāi)設(shè)該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并且也未涉及到任何分子微生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)；因此，增加該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容改變學(xué)生認(rèn)為微生物學(xué)與分子生物學(xué)似乎沒(méi)有任何關(guān)系的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)，并且也掌握了分子微生物中基本操作技術(shù).

1.5 16S rDNA序列的比對(duì)及其分析

該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要是要求學(xué)生學(xué)會(huì)對(duì)測(cè)序結(jié)果的拼接和分析.將測(cè)序公司獲得的細(xì)菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast程序進(jìn)行比對(duì)分析，然后根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果可初步鑒定學(xué)生分離獲得的菌株為與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源性達(dá)到99%～100%的16S rDNA菌株應(yīng)該為分類地位一致的菌株.通過(guò)該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的教學(xué)實(shí)施，使學(xué)生掌握了部分生物信息學(xué)軟件的使用以及DNA序列的同源比對(duì)分析；該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生初步的了解涉及生物信息學(xué)的內(nèi)容.由于目前生物信息學(xué)是一門(mén)發(fā)展迅速的學(xué)科，該學(xué)科是一門(mén)交叉學(xué)科，為剖析生命現(xiàn)象本質(zhì)的生命科學(xué)研究工作者共同關(guān)注的焦點(diǎn)，是今后生命科學(xué)發(fā)展的重要學(xué)科組成部分之一.通過(guò)該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的可使學(xué)生了解到微生物學(xué)科與其他學(xué)科的緊密聯(lián)系，也對(duì)生物信息學(xué)的具體應(yīng)用具有一定的了解和掌握.

1.6 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的生理生化鑒定

安排學(xué)生根據(jù)第四次實(shí)驗(yàn)和第五次實(shí)驗(yàn)的初步鑒定結(jié)果，參考細(xì)菌鑒定分類手冊(cè)(如東秀珠和蔡妙英主編的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》)中相應(yīng)種屬的微生物生理生化實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，選取全部或部分指標(biāo)開(kāi)設(shè)相應(yīng)的生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)，比如V-P、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、明膠液化和多種糖類的產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn).由于鑒定過(guò)程中涉及生理生化指標(biāo)較多，因此實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較多；將全班學(xué)生分為多個(gè)組別進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)內(nèi)容，學(xué)生之間必須相互交流觀察不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后歸納統(tǒng)一全部的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.比較學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與鑒定手冊(cè)上的指標(biāo)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明該菌株是該屬種的菌株.對(duì)于菌株的鑒定需采用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為實(shí)驗(yàn)的參考對(duì)象；而實(shí)驗(yàn)室未有的標(biāo)準(zhǔn)菌株根據(jù)購(gòu)買(mǎi)菌株的費(fèi)用、實(shí)驗(yàn)時(shí)間的安排等多方面的實(shí)際因素相結(jié)合是否安排學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是學(xué)生必須知道實(shí)驗(yàn)之中一定需要用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參考對(duì)象.

1.7 產(chǎn)蛋白酶菌的培養(yǎng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

本次實(shí)驗(yàn)安排學(xué)生采用液體培養(yǎng)方式研究不同的碳源、氮源、金屬離子和起始pH值等因素對(duì)分離獲得的菌株產(chǎn)生蛋白酶量的影響［3］.實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖40 g，蛋白胨 20 g，Na2HPO41.4 g，CaCl20.6 g，MgSO40.4 g，水1 000 mL.碳源實(shí)驗(yàn)是以等量的蔗糖、葡萄糖、玉米粉和淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖；氮源實(shí)驗(yàn)是以等量的牛肉膏、干酪素、(NH4)2SO4、蛋白胨和大豆豆粕代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨；金屬離子實(shí)驗(yàn)是去掉基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的Na2HPO4、CaCl2和MgSO4，然后分別添加0.001 mol/L的CuSO4、Zn-SO4、MgSO4、K2SO4、MnSO4和FeSO4等無(wú)機(jī)鹽；起始pH值實(shí)驗(yàn)是分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的起始pH值為6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.實(shí)驗(yàn)前安排學(xué)生首先將菌株接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h后作為種子菌，按5%的接種量分別接種至上述不同實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的裝液量為250 mL三角瓶中裝25 mL液體培養(yǎng)基量，37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)后，離心收集菌體沉淀稱其濕重，并且收集上清液后，采用Folin-酚法測(cè)定其酶活.該實(shí)驗(yàn)的實(shí)施使學(xué)生認(rèn)識(shí)培到培養(yǎng)條件對(duì)微生物菌株的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物的影響顯著，并且使傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件對(duì)微生物生長(zhǎng)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)改為了研究型實(shí)驗(yàn).

1.8 篩選菌株的誘變選育

在微生物中自發(fā)突變的概率極低，變異程度輕微，從自然界中直接篩選獲得能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的高產(chǎn)菌株的幾率較低；因此，在實(shí)際生產(chǎn)中常常采用紫外誘變和化學(xué)誘變的手段對(duì)菌株進(jìn)行誘變選育處理，從而獲得高產(chǎn)的菌株.本實(shí)驗(yàn)采用紫外誘變和化學(xué)誘變的方法對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行誘變處理，以期獲得產(chǎn)蛋白酶量提高的菌株.安排學(xué)生上課前一天接種菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)過(guò)夜備用；采用化學(xué)誘變劑亞硝基胍的處理過(guò)程如下：取振蕩過(guò)夜的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，然后挑取少許亞硝基胍粉末點(diǎn)于平板上，待粉末溶解，平板于37℃倒置培養(yǎng)至有明顯的菌落長(zhǎng)出后，從亞硝基胍邊緣取菌苔于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行2～6 h的中間培養(yǎng)過(guò)程.然后將菌懸液稀釋后涂布于牛奶培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)1～2 d，測(cè)量并計(jì)算水解圈的直徑與菌落直徑之比，通過(guò)與出發(fā)菌株比較是否具有產(chǎn)生蛋白酶量提高的突變菌株［1］.對(duì)于紫外誘變處理的過(guò)程如下：將菌懸液離心收集菌體后，通過(guò)紫外燈照射進(jìn)行誘變處理，涂布于牛奶培養(yǎng)基表面，采用化學(xué)誘變計(jì)算的方法比較與其出發(fā)菌株產(chǎn)生蛋白酶是否有提高的突變菌株.最后還要求學(xué)生評(píng)價(jià)兩種誘變方法的效果.通過(guò)該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生了解紫外線和化學(xué)誘變劑均可誘導(dǎo)基因的突變，并且掌握這兩種較為有效的的提高目的菌株生產(chǎn)性能的方法.

2 實(shí)驗(yàn)的考核與不足

由于該綜合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之間的關(guān)聯(lián)性和邏輯性較強(qiáng)，中間環(huán)節(jié)的每一次實(shí)驗(yàn)均需要獲得成功才能較順利實(shí)施下一步實(shí)驗(yàn)；因此，在考核學(xué)生時(shí)，將學(xué)生每次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為重要的衡量指標(biāo).對(duì)于實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)，改變常規(guī)將每個(gè)實(shí)驗(yàn)都書(shū)寫(xiě)為一個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的方式，而是要求學(xué)生將所有的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容整合在一起，并且按照發(fā)表論文的格式進(jìn)行書(shū)寫(xiě)，即寫(xiě)出論文摘要、前言、方法材料、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論和結(jié)論幾個(gè)部分.因此學(xué)生的實(shí)驗(yàn)考核成績(jī)主要由學(xué)生的實(shí)驗(yàn)態(tài)度、動(dòng)手操作技能、每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)論文等幾個(gè)部分組成.

對(duì)于采用上述方式開(kāi)設(shè)綜合性的教學(xué)實(shí)驗(yàn)也存在一些不足和問(wèn)題：（1）對(duì)于教師和學(xué)生而言，與常規(guī)開(kāi)設(shè)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容相比均增加了較大的工作量.（2）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，部分學(xué)生可能不能獲得理想結(jié)果，因此需要學(xué)生之間相互幫組，學(xué)生之間共享一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果.總之，對(duì)于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)可以全面系統(tǒng)地提高學(xué)生的理論知識(shí)及其操作動(dòng)手能力，并且使學(xué)生懂得和理解科學(xué)研究的不易，同時(shí)也能享受科學(xué)研究成功帶來(lái)的喜悅.

［1］沈萍,陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.4版.北京:高等教育出版社,2010.

［2］羅劍飛.硫氧化菌群落結(jié)構(gòu)分析及其特性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2011:32.

［3］歐平,梁靜娟,龐宗文.一株產(chǎn)大豆蛋白酶的芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(2):133-139.