脂氧素對子前期大鼠治療的研究*

張俊農 賀 鶴 董 微

妊娠期高血壓疾病是產科最常見的合并癥，也是導致孕產婦和圍生兒患病率及死亡率增加的常見原因之一。其確切病因和發病機制的研究一直是婦產科領域的重要研究課題。目前比較公認的發病機制是內皮細胞激活和損傷學說。現今醫學對其治療以解痙降壓、適時終止妊娠為主，缺乏有效的早期治療手段。探索妊娠期高血壓疾病早期治療的途徑成為國內外學者關注的熱點。有研究表明，靜脈注射脂氧素（lipoxins，LX）A4會使有高血壓疾病的小鼠全身和局部血壓下降，而對正常大鼠血壓并無影響，這對于子前期的治療具有重要意義[1]。本研究旨在研究LXA4對子前期大鼠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇3～4個月齡的SPF級雌性SD大鼠30只，另選擇3～4個月齡的SPF級雄性SD大鼠15只，按雄雌比1∶2的比例進行雌雄合籠，以發現雌性大鼠陰栓當日記為孕第1天，隨機將妊娠大鼠分為正常組、內毒素組和LX組（內毒素+LXA4），每組10只。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制備 測孕前及妊娠第8天上午9：00～12：00基礎血壓、大鼠體質量及24 h尿蛋白，妊娠第14天給內毒素組和LX組大鼠尾靜脈注入內毒素1.0 μg/kg，輸入速度為2 mL/h，繼續測量孕鼠妊娠第15、18天血壓及24 h尿蛋白，自第15天逐漸升高，且第15、18天24 h尿蛋白明顯增加，表現為高血壓、蛋白尿及炎癥反應的激活，與子前期表現一致，表明建模成功。妊娠第14天，LX組尾靜脈注入LXA4注射液0.7 mg/kg，正常組和內毒素組大鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.2.2 測量指標 于妊娠第20天手術取出子鼠，測量新生鼠體質量。同時從大鼠腹主動脈采血5 mL,置入含抗凝劑的試管中，室溫下2 000 r/min離心5 min，取上清液，-20℃保存待用。采用硝酸還原酶法測定NO濃度，試劑購自南京建成生物有限公司。應用雙抗體夾心法測定標本大鼠LX水平。酶聯免疫吸附實驗(ELISA）試劑盒購自美國R&D公司。方法：在酶標板加樣50 μL，加稀釋液40 μL及待測樣品10 μL，經溫育洗滌后，每孔依次加入顯色劑A50 μL，B50 μL，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μL終止反應（此時藍色立轉黃色），450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD）值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件包進行統計學分析，計量資料以± s表示，2組比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕鼠孕前與孕第8天指標比較 3組于孕前及受孕第8天時平均動脈壓、大鼠體質量、24 h尿蛋白及基礎脂氧素水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。正常組、內毒素組和LX組孕第8天體質量高于孕前（t分別為2.75、2.91、2.63，P<0.05），3組孕第8天的脂氧素水平均高于孕前（t分別為3.84、7.84、9.13，P<0.05）。

Table 1 Comparison of index before pregnancy and 8 days afer conception表1 孕前與孕第8天各指標比較(n=10± s)

Table 1 Comparison of index before pregnancy and 8 days afer conception表1 孕前與孕第8天各指標比較(n=10± s)

均P>0.05，1 mm Hg=0.133 kPa

組別正常組內毒素組LX組F孕前平均動脈壓(mm Hg)128.34±10.11 129.28±10.09 128.68±11.03 2.89體質量(g)269.02±17.31 270.45±16.54 270.38±16.40 3.00 24 h尿蛋白(mg)0.014±0.001 0.013±0.003 0.015±0.002 2.95脂氧素(ng/L)33.27±1.88 34.25±1.96 33.59±1.78 2.77組別正常組內毒素組LX組F孕第8天平均動脈壓(mm Hg)129.29±9.98 127.57±10.12 128.34±10.09 3.11體質量(g)275.12±18.12 277.36±17.92 275.56±19.24 2.93 24 h尿蛋白(mg)0.013±0.000 0.014±0.001 0.013±0.000 2.88脂氧素(ng/L)40.88±1.97 41.22±2.01 41.99±2.30 2.56

2.2 各組孕第8天、第15天與孕第18天指標比較 內毒素組孕第15天平均動脈壓及24 h尿蛋白與孕第8天時比較明顯升高（t分別為3.2，36.69，P<0.05）；LX組于孕第15天時平均動脈壓及24 h尿蛋白較第8天有所升高，差異有統計學意義（t分別為3.4，46.17，P<0.05）。孕第18天時，LX組平均動脈壓和24 h尿蛋白較孕第15天時均有下降（t分別為3.5，37.43，P<0.05），也低于內毒素組（P<0.05），且內毒素組脂氧素水平較正常組及LX組水平下降，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

Table 2 Comparison of pregnant index of 15 days and 18 days after conception表2 孕第15天及孕第18天各指標比較 (n=10±s)

Table 2 Comparison of pregnant index of 15 days and 18 days after conception表2 孕第15天及孕第18天各指標比較 (n=10±s)

＊＊P<0.01，a與正常組比較P<0.05，b與內毒素組比較P<0.05，表3同

組別正常組內毒素組LX組F孕第18天平均動脈壓(mm Hg)129.24±9.98 139.29±10.13a 128.12±10.24b 347.88＊＊24 h尿蛋白(mg)0.012±0.002 0.091±0.007a 0.017±0.003b 221.38＊＊脂氧素(ng/L)50.92±3.11 41.98±3.36a 53.35±3.18b 259.28＊＊組別正常組內毒素組LX組F孕第15天平均動脈壓(mm Hg)125.23±8.24 135.68±9.97a 135.98±7.49 111.90＊＊24 h尿蛋白(mg)0.011±0.001 0.085±0.006a 0.086±0.005 189.05＊＊

2.3 3組間子鼠體質量和孕鼠NO水平比較 孕第20天時，LX組NO濃度較內毒素組升高（P<0.05），與正常組比較差異無統計學意義（P>0.05）。正常組與LX組子鼠體質量均高于內毒素組(P<0.05)，LX組與正常組比較差異無統計學意義，見表3。

3 討論

3.1 脂氧素的生物學作用 LX是20世紀80年代被發現的二十烷類中一類花生四烯酸代謝產物，能有效調節細胞炎性氧化損傷[2]。阿司匹林誘生的脂氧素，通過與細胞表面高親和力的脂氧素受體結合發揮生物效應，其廣泛分布于骨髓源性細胞。已有的研究表明，利用人工合成的脂氧素穩定的同系物如15-環己基-LXA4等已成功地治療了動物實驗性關節炎、腎小球腎炎、急性肺損傷等免疫炎性疾病[3]。脂氧素通過抑制其細胞因子表達來抑制促炎細胞活性。還能抑制血管內皮生長因子引起的新生血管形成[1，4]。研究表明，脂氧素調節免疫反應的機制不同于白細胞介素(IL)-10、地塞米松等免疫抑制劑，并不影響機體正常的免疫反應[5]。作為一種新的免疫調節劑，其應用前景十分廣闊。

Table 3 Comparison of body weights of newborn rats and NO levels of pregnant rats between three groups表3 3組孕第20天子鼠體質量及孕鼠NO水平比較(n=10± s)

Table 3 Comparison of body weights of newborn rats and NO levels of pregnant rats between three groups表3 3組孕第20天子鼠體質量及孕鼠NO水平比較(n=10± s)

組別正常組內毒素組LX組F子鼠體質量（mg）3.69±0.39 2.44±0.39a 3.64±0.31b 336.12＊＊NO（μmol/g）14.57±3.53 9.75±6.40a 12.64±4.51b 229.90＊＊

3.3 前景 脂氧素病生理作用受何種機制調控，其對妊娠期高血壓疾病治療的影響等，還需要進一步深入研究。開發穩定且可以通過胎盤屏障的脂氧素同系物，研制具有臨床應用價值，安全可靠的新型抗炎、免疫調節的多效藥物，可以為攻克妊娠期高血壓疾病這一頑疾開辟嶄新的道路。

[1]Liu S,Wu P,Ye D，et al.Effects of lipoxin A(4)on CoCl(2)-induced angiogenesis and its possible[J].Pharmacology,2009,84(1):17-23.

[2]Schwab JM,Serhan CN.Lipoxins and new lipid mediators in the res?olution of inflammation[J].Curr Opin Pharmacol,2006,6（4）:414-420.

[3]Jin SW,Zhang L,Lian QQ,et al.Posttreatment with aspirin-trig?gered lipoxin A4 analog attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice:the role of hemeoxygenase-1[J].Anesth Analg,2007,104（2）:369-377.

[4]Cezar-de-Mello PF,Vieira AM,Nascimento-Silva V,et al.ATL-1,an analogue of aspirin-triggered lipoxin A4,is a potent inhibitor of several steps in angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor[J].Br J Pharmacol，2008，153(5):956-965.

[5]Machado FS,Aliberti J.Lipoxins as an immune-escape mechanism[J].Adv Exp Med Biol，2009，666:78-87.

[6]劉松君,李詠生,周曉燕,等.脂氧素A4對缺氧損傷的人臍靜脈內皮細胞的保護作用[J].中華婦產科雜志,2009,44(4):281-284.

[7]吳敏,倪鐫,劉小利,等.脂氧素對重度子癇前期患者外周血中性粒細胞凋亡的影響[J].中華圍產醫學雜志,2009,12(2):146-148.

[8]Luizon MR,Sandrim VC,Palei AC,et al.Epistasis among eNOS,MMP-9 and VEGF maternal genotypes in hypertensive disorders of pregnancy[J].Hypertens Res,2012，35（9）：917-921.

[9]Matsubara K,Matsubara Y,Hyodo S,et al.Role of nitric oxide and reactive oxygen species in the pathogenesis of preeclampsia[J].J Ob?stet Gynaecol Res,2010,36(2):239-247.

[10]von der Weid PY,Hollenberg MD,Fiorucci S,et al.Aspirin-trig?gered,cyclooxygenase-2-dependent lipoxin synthesis modulates vascular tone[J].Circulation,2004,110(10):1320-1325.