桑葉HILIC特征指紋圖譜研究

東莎莎，趙恒強(qiáng)，王 曉，崔清華，耿巖玲，劉代成，劉建華，王小如

(1．山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014;2．山東省科學(xué)院 中藥過程控制研究中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014;3．國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島市現(xiàn)代分析技術(shù)及中藥標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061;4．山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

桑葉為桑屬植物桑樹(Morus alba L．)的樹葉，據(jù)《中藥志》記載，桑葉具有“清風(fēng)散熱、清肺潤(rùn)燥、涼血明目”等功效［1］。現(xiàn)代研究表明，桑葉中含有多種活性物質(zhì)，如黃酮類、生物堿、有機(jī)酸、氨基酸、揮發(fā)油、三萜類等化合物，具有降血糖、降血壓、降低膽固醇、抗衰老、提高免疫力、抗菌、抗病毒、防癌等多種生理功能［2］。目前，國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)桑葉藥材的需求越來越大［3］，桑葉功能活性成分在食品、醫(yī)藥、保健品中的應(yīng)用范圍也越來越廣［4］。然而不同產(chǎn)區(qū)桑葉的品質(zhì)差別顯著［5］，嚴(yán)重影響了桑葉藥材的開發(fā)利用和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性。因此，開展桑葉藥材的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別方法研究，對(duì)控制桑葉藥材質(zhì)量，保障桑葉藥材合理開發(fā)利用具有重要意義。

指紋圖譜技術(shù)已成為國(guó)際上公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段［6］。色譜指紋圖譜有很強(qiáng)的分離效能，且能夠與多種檢測(cè)器聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)各種波譜信息的定性及定量分析［7］，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制。桑葉藥材所含化學(xué)成分種類多，極性差異大。根據(jù)不同種類化學(xué)成分的特點(diǎn)發(fā)展與之適應(yīng)的分析方法，對(duì)有效表征桑葉化學(xué)成分，全面控制其質(zhì)量具有重要意義。目前已發(fā)展了多種針對(duì)桑葉藥材的指紋圖譜方法，主要有高效液相色譜法(HPLC)［8－9］、氣相色譜 －質(zhì)譜法(GCMS)［10］、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)［11］等。另外，在2010版《中國(guó)藥典》中也采用反相高效液相色譜法(RP－HPLC)對(duì)桑葉有效成分進(jìn)行分析［12］。但HPLC法主要針對(duì)中等極性成分，GC－MS法主要針對(duì)弱極性和揮發(fā)性成分。HPCE法雖然較適用于中等極性和強(qiáng)極性化學(xué)成分的分析，但其靈敏度低、重復(fù)性差、與質(zhì)譜聯(lián)用復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。

親水色譜法(HILIC)是20世紀(jì)90年代新發(fā)展起來的一種色譜分離技術(shù)，它采用強(qiáng)極性材料作為固定相，特別適合強(qiáng)極性和親水性化合物的保留和分離［13］。另外，其采用高比例的乙腈－水作為流動(dòng)相，與質(zhì)譜聯(lián)用可使目標(biāo)化合物更易離子化、信號(hào)較強(qiáng)。相反，用RP－HPLC分離強(qiáng)極性和親水性化合物時(shí)，流動(dòng)相中因需要有高比例的水，而影響色譜柱使用壽命;另外，高比例的水會(huì)影響化合物在電噴霧離子源中的離子化效率，不利于質(zhì)譜鑒別。由此可見，HILIC相比RP－HPLC更適合親水性化合物的分析測(cè)定。目前，HILIC法在中草藥和天然藥物中極性成分的分析研究中已有應(yīng)用［14－15］，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但在桑葉藥材強(qiáng)極性成分的分析和質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用未見報(bào)道。本文首次開展桑葉藥材的HILIC特征指紋圖譜研究，為全面、有效地控制桑葉藥材的質(zhì)量和真?zhèn)舞b別提供方法和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

安捷倫1200高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、梯度泵、恒溫箱、二極管陣列檢測(cè)器);G6520A型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有ESI離子源(美國(guó)Agilent公司);萬分之一電子分析天平(Mettcer AE240)、指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件為“中藥色譜指紋相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(中國(guó)藥典委員會(huì)2004A);KQ2400 KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);Buchi型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific)，甲醇(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，甲酸、甲酸銨(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(18 MΩ)。12批不同產(chǎn)地的桑葉樣品購(gòu)于濟(jì)南市各大藥店，樣品信息見表1。

表1 桑葉樣品來源Table 1 Samples used in the works

1.2 供試品溶液的制備

桑葉藥材粉碎，過20～40目篩，精密稱取桑葉粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇，超聲提取20 min，重復(fù)提取1次，將濾液過濾后合并，于55℃下旋蒸至干，用90%的乙腈重新溶解提取物并定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。

1.3 親水色譜條件

XBridgeTMAmide親水色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm，美國(guó)Waters公司)，流動(dòng)相:A為水(含0.2%甲酸、20 mmol/L甲酸銨、20%甲醇)，B為乙腈，流速0.8 mL·min－1;柱溫為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm;進(jìn)樣量20 μL，梯度洗脫程序?yàn)?0→15→25→30→40→50→55→65→70 min，B%:92%→90%→90%→87%→86%→82%→80%→80%→50%。

1.4 電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜條件

進(jìn)入ESI－TOF/MS的流動(dòng)相流速為0.4 mL/min;ESI+模式;掃描范圍(m/z):50～1 500;干燥氣流速:10.0 L·min－1;噴霧氣壓:275.8 kPa;氣體溫度:300℃;毛細(xì)管電壓:4.5 kV;破碎電壓:120 V;錐孔電壓:60 V;參比液:m/z 121.050 9，922.009 8;分辨率:9 500±500(922.009 8)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品溶液制備方法的優(yōu)化

超聲提取技術(shù)利用超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)，加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高提取率，縮短提取時(shí)間，并且避免了高溫對(duì)提取成分的影響［16］。本研究將超聲提取法用于桑葉親水色譜指紋圖譜研究。提取溶劑、提取時(shí)間、提取次數(shù)等參數(shù)均是影響提取率的關(guān)鍵因素。對(duì)比了純水和不同比例甲醇水作為提取溶劑時(shí)的HILIC色譜圖。結(jié)果表明，甲醇水提取物的HILIC色譜圖中，色譜峰明顯增多，分布均勻，峰強(qiáng)度亦明顯增大，而純水提取物色譜峰主要分布在色譜圖的中間和后半時(shí)間段。說明HILIC法不但對(duì)強(qiáng)極性成分有較好的保留和分離效果，同時(shí)也適用于部分中等極性成分的保留和分離。其對(duì)應(yīng)的親水色譜圖反應(yīng)出的化學(xué)成分信息量明顯增加，指紋特征更加明顯，特征性更強(qiáng)，提高了指紋圖譜的整體性和特征性。因此，最終采用50%甲醇水溶液作為提取溶劑。在優(yōu)化的提取溶劑條件下，考察了不同提取時(shí)間(15、20、25 min)和提取次數(shù)(1、2、3次)的影響。結(jié)果表明，選擇桑葉樣品的提取時(shí)間為20 min，連續(xù)提取2次時(shí)，桑葉甲醇水提取物特征峰較高、指紋特征明顯。因此，最終選擇提取時(shí)間為20 min，連續(xù)提取2次。

2.2 親水色譜條件優(yōu)化

本研究在前期工作中曾對(duì)桑葉甲醇水提取液在反相色譜柱上的保留和分離情況進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，桑葉甲醇水提取液在反相色譜圖的前半段色譜峰峰形較差、分離度不好，說明桑葉提取物中的強(qiáng)極性成分在反相柱上的保留和分離效果較差。因此，本研究采用親水柱用于桑葉甲醇水提取物的色譜分離研究，并對(duì)親水色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。由于桑葉的化學(xué)成分復(fù)雜，采用等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)其分離，因此選擇梯度洗脫。乙腈－水體系常用于親水色譜流動(dòng)相，桑葉甲醇水提取液中的強(qiáng)極性和中等極性成分共存，單獨(dú)采用乙腈－水體系難以實(shí)現(xiàn)各化合物的有效分離。而采用乙腈－水－甲醇三元混合體系時(shí)，桑葉甲醇水提取物中各化合物具有良好的保留和分離效果。考察了流動(dòng)相pH值和緩沖鹽濃度等對(duì)親水色譜分離效果的影響，結(jié)果表明，選擇0.2%HCOOH+20 mmol/L HCOONH4作為流動(dòng)相A時(shí)，桑葉甲醇水提取物中各化合物的分離度較好，峰形尖銳。采用光電二極管陣列檢測(cè)器考察桑葉樣品在不同波長(zhǎng)(100～400 nm)下的親水色譜圖，結(jié)果表明，在203、256、265 nm和322 nm時(shí)色譜峰均較多，但在203、256 nm和265 nm時(shí)，色譜圖基線不平，干擾較大;而在322 nm處色譜峰較多，各峰分離度較好，基線平穩(wěn)，因此，本研究選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm。改變色譜柱溫度對(duì)色譜分離效果影響不大，但溫度對(duì)色譜柱的重現(xiàn)性有一定影響，在本研究過程中，色譜柱溫度控制在25℃(室溫)，以保證色譜分析過程的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。在優(yōu)化的親水色譜條件下，桑葉甲醇水提取物的親水色譜圖如圖1所示。

2.3 指紋圖譜的建立及特征峰的指認(rèn)

取10批不同批次的桑葉樣品，按“1.2”方法制備成供試品溶液，按“1.3”親水色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖，建立桑葉樣品的HILIC特征指紋圖譜，10批桑葉樣品的色譜圖見圖2。在本研究所建立的分析系統(tǒng)下，10批桑葉甲醇水提取物化學(xué)成分的出峰時(shí)間均在65 min之前，主要有17個(gè)共有峰。其中，特征性明顯的主要有4個(gè)色譜峰，這4個(gè)色譜峰即構(gòu)成桑葉HILIC指紋圖譜的特征峰(分別為峰3、9、11、15)(見圖1)。其中9號(hào)峰(綠原酸)的峰面積最大，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保留時(shí)間以及峰面積的重復(fù)性良好，特征性強(qiáng)，與其它相鄰峰分離良好，采用化學(xué)工作站計(jì)算該峰的純度發(fā)現(xiàn)該峰為一純化合物，因此選擇9號(hào)峰為參照峰(相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均設(shè)為1)，用于計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積(見表2～3)。從表2～3數(shù)據(jù)可以看出，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%，進(jìn)一步說明本方法的可靠性;各峰相對(duì)峰面積的RSD值較大，但不同桑葉樣品指紋圖譜的輪廓特征一致(見圖2)。

圖1 桑葉提取物的親水色譜圖Fig.1 HILIC chromatogram for the extract of mulberry leaves

圖2 10批桑葉的HILIC特征指紋圖譜Fig.2 HILIC characteristic fingerprint of 10 batches of mulberry leaves

表2 相對(duì)保留時(shí)間Table 2 Relative retention time

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 精密稱取桑葉樣品，按“1.2”方法制成供試品溶液，按“1.3”親水色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)得其中4個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。4個(gè)特征峰保留時(shí)間的RSD依次為0.86%、0.62%、0.28%、0.22%，均小于1%，峰面積RSD依次為1.9%、2.1%、3.8%、0.59%，均小于5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性 精密稱取同一桑葉樣品6份，按“1.2”方法制成供試品溶液，按“1.3”親水色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得4個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。4個(gè)特征峰保留時(shí)間的RSD依次為0.65%、0.38%、0.28%、0.26%，均小于1%，峰面積RSD依次為1.2%、4.5%、1.3%、4.2%，均小于5%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。2.4.3 穩(wěn)定性 按照“1.3”親水色譜條件，將供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。4個(gè)特征峰保留時(shí)間的RSD依次為0.81%、0.75%、0.24%、0.18%，均小于1%，峰面積RSD依次為2.7%、2.9%、5.0%、5.0%，均不大于5%，表明樣品在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

表3 相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak area

在優(yōu)化的親水色譜條件下，采用親水色譜－電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)桑葉甲醇水提取物HILIC色譜圖中的4個(gè)特征峰進(jìn)行表征。結(jié)果表明，在正離子模式下，4個(gè)特征峰有較好的質(zhì)譜信號(hào)。采用離子源預(yù)設(shè)的參數(shù)，各特征峰的信號(hào)較強(qiáng)。根據(jù)電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得的化合物的精確分子量信息和DAD檢測(cè)器獲得的紫外吸收信息，并參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)4個(gè)特征峰進(jìn)行了初步鑒別，結(jié)果見表4。從表4可以看出，4個(gè)特征峰中3、9、11號(hào)峰分別為槲皮苷、綠原酸、蘆丁，均為桑葉中的重要活性成分。

表4 4個(gè)特征峰的電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別結(jié)果Table 4 ESI－TOF/MS accurate mass measurements of the 4 characteristic peaks

2.5 相似度評(píng)價(jià)

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(《中國(guó)藥典》2004 A版)對(duì)10批山東產(chǎn)區(qū)桑葉藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，選定上述17個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，采用共有模式作為對(duì)照指紋圖譜，用于10批桑葉藥材的相似度評(píng)價(jià)，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均在0.90以上(見表5)，說明這10批桑葉藥材的質(zhì)量差別不明顯。而兩個(gè)安徽、湖北來源的桑葉樣品相似度較低，其值均在0.90以下，說明不同產(chǎn)區(qū)的桑葉藥材質(zhì)量差異顯著。由此可以看出，本研究發(fā)展的HILIC特征指紋圖譜能夠反映桑葉藥材的固有屬性，結(jié)合相似度分析，可以用于不同產(chǎn)區(qū)桑葉藥材的辨別。

表5 相似度計(jì)算結(jié)果Table 5 Similarity calculations

3 結(jié)論

本研究以桑葉甲醇水提取物為研究對(duì)象，建立了桑葉藥材的HILIC特征指紋圖譜。在優(yōu)化的親水色譜條件下，桑葉甲醇水提取物中的各化合物分離良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法具有較好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。在多批次樣品分析的基礎(chǔ)上建立的桑葉親水色譜指紋圖譜，結(jié)合相似度分析可用于不同產(chǎn)區(qū)桑葉藥材的正確區(qū)分。本研究為更加全面、有效地控制桑葉藥材的質(zhì)量和真?zhèn)舞b別研究提供了方法和技術(shù)支持。

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