丹酚酸B口服微乳的處方設(shè)計(jì)及含量測定*

馬 麗 ，劉志東 ，李 楠 ，孫精通 ，張 倩 ，葉麗娜

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津 300193；3天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 300193）

丹酚酸B（Sal B）由三分子的丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，為丹參的水溶性酚酸類成分，是丹參制劑的主要有效成分。目前，含Sal B的劑型有片劑、粉針劑、注射劑和滴丸劑等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，Sal B具有抗氧化[1]、抗肝臟纖維化及心臟、腦保護(hù)等作用[2]。但文獻(xiàn)報(bào)道，Sal B口服生物利用度極低[3]，大大降低了其臨床療效。Sal B水溶性好，對一些水溶性好而口服吸收差的藥物，制成油包水（W/O）型微乳可明顯提高其生物利用度。

微乳（ME）是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑組成的光學(xué)上各向同性，熱力學(xué)穩(wěn)定的液態(tài)體系，粒徑在10～100 nm之間，又稱納米乳[4]。微乳劑按照結(jié)構(gòu)分為水包油型、油包水型和雙連續(xù)型。油包水型微乳能夠增溶水溶性藥物，提高水溶性藥物的穩(wěn)定性和生物利用度[5]。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備Sal B的W/O型微乳，以改善其口服吸收。

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀（COMETRO6000，美國）；C3860A超聲清洗器（天津Autoscience公司）；磁力攪拌SZCL-4B（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

丹酚酸B對照品（天津一方科技有限公司，98%）；丹酚酸B提取物（天津中一制藥有限公司）；大豆卵磷脂（PC），（北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司）；辛酸/癸酸甘油酯（Miglyol 812，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司）；Maisine 35-1、Labrafil M 1944CS（法國Gattefosse公司）；辛癸酸甘油酯（GTCC）、棕櫚酸異丙酯（IPP）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）（浙江物美化學(xué)品有限公司）；甲醇、乙腈（天津康科德科技有限公司，色譜純）；其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 W/O型微乳偽三元相圖的制備 精密稱取表面活性劑和助表面活性劑按一定質(zhì)量比溶解混勻?yàn)榛旌媳砻婊钚詣〈嘶旌媳砻婊钚詣┡c油相按不同比例（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）混合后加入西林瓶中，滴加至 pH2.0 的水相[9-10]，并不斷振搖使體系充分混勻，當(dāng)體系由澄清透明變渾濁時(shí)為臨界點(diǎn)，記錄臨界點(diǎn)時(shí)加入水相的量，由油相、水相、混和表面活性劑在臨界點(diǎn)的各自質(zhì)量百分?jǐn)?shù)（W/W）繪制偽三元相圖，確定微乳區(qū)，M作為標(biāo)記。AutoCAD2007軟件計(jì)算微乳區(qū)域面積。

2.2 處方篩選

2.2.1 表面活性劑與助表面活性劑的選擇 考察表面活性劑PC、司盤80（Span 80）和助表面活性劑1，2-丙二醇、無水乙醇、聚乙二醇 400（PEG400）的互溶情況，初步篩選混合表面活性劑的組成，結(jié)果PC與Span 80在1，2-丙二醇、PEG400中皆不溶，二者均溶于無水乙醇，以大豆卵磷脂/無水乙醇（PC/E-tOH）、司盤 80/無水乙醇（Span 80/EtOH）、大豆卵磷脂/司盤 80/無水乙醇（PC/Span 80/EtOH）為混合表面活性劑，IPM為油相，固定Km值為1，制備溫度為30℃，繪制偽三元相圖，計(jì)算微乳區(qū)域面積，結(jié)果見圖1。

圖1 乳化劑種類對偽三元相圖中微乳區(qū)域面積的影響Fig.1 Effect of emulsifier types on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

由圖1可知，Span 80/EtOH及PC/Span 80/E－tOH與油混合后可以與水相形成微乳，但載水量較低，PC/EtOH與油混合后，載水量較大，微乳區(qū)域所占的比例較大，且PC安全無毒，生物相容性好，所以最終確定PC/EtOH為混合表面活性劑。

2.2.2 油相的選擇 選用Miglyol 812、GTCC、Maisine 35-1、Labrafil M 1944CS、IPP、IPM 為油相，以PC/EtOH作為混合表面活性劑，固定Km值為1，溫度30℃，繪制偽三元相圖，考察不同處方微乳區(qū)域大小。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，采用Maisine35-1、LabrafilM1944CS為油相較Miglyol 812、GTCC、IPP和IPM具有較大的微乳形成區(qū)域，載水量較高。其中Maisine 35-1熔點(diǎn)較高，形成微乳黏性較大，以Labrafil M 1944CS為油相，微乳黏度較低且載水量較高。所以選擇Labrafil M 1944CS作為油相。

公共建筑、大型和高層建筑等作為人流聚集區(qū)域，突發(fā)事件的響應(yīng)能力非常重要。BIM運(yùn)維管理平臺可利用BIM模擬性優(yōu)勢，利用相關(guān)模擬軟件，進(jìn)行人員疏散、車輛疏散和火災(zāi)煙氣擴(kuò)散等模擬，可對突發(fā)事件進(jìn)行預(yù)防、警報(bào)和處理，為科學(xué)決策提供依據(jù)。

2.2.3 Sal B加入前后對微乳形成的影響 以Labrafil M 1944CS為油相，PC/EtOH作為混合表面活性劑，固定Km值等于1，實(shí)驗(yàn)溫度30℃，考察丹酚酸B溶液（45 mg/mL）加入前后對微乳形成的影響。結(jié)果見圖3。由圖3可知，丹酚酸B加入后，其微乳形成區(qū)域較空白微乳減小，說明藥物自身的性質(zhì)影響了微乳的形成，由此推測藥物濃度可能影響微乳的形成，需要進(jìn)一步考察。

圖3 藥物加入前后對偽三元相圖中微乳區(qū)域面積的影響Fig.3 Effect before and after adding the drug on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

2.2.4 藥物濃度對微乳形成的影響 以PC/EtOH為混合表面活性劑，Labrafil M 1944CS為油相，固定Km值為1，實(shí)驗(yàn)溫度30℃，考察考察不同藥物濃度（45 mg/mL，22.5 mg/mL）對微乳形成的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 藥物濃度對偽三元相圖中微乳區(qū)域面積的影響Fig.4 Effect of the concentration of drug on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

由圖4可知，丹酚酸B溶液濃度為22.5 mg/mL時(shí)微乳形成區(qū)域較45 mg/mL時(shí)大，但考慮微乳載藥量，仍選用丹酚酸B溶液濃度為45 mg/mL作為供試液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2.5 Km值大小對微乳形成的影響 Km值是影響微乳形成的一個(gè)重要因素，以Labrafil M 1944CS為油相，實(shí)驗(yàn)溫度30℃，藥物濃度為45 mg/mL，考察Km值（Km值等于1/2、1、2）對微乳形成的影響。結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著Km值由1/2到2，微乳形成區(qū)域逐漸增大，說明增大Km值有利于微乳的形成，但卵磷脂比例大，會造成微乳粘性增強(qiáng)，不利于口服制劑的吸收，所以選擇Km為1。

2.2.6 溫度對微乳形成的影響 溫度可影響微乳的形成，且影響較大，以PC/EtOH為混合表面活性劑，LabrafilM1944CS為油相，考察溫度（20℃、30℃、40℃）對微乳形成的影響。結(jié)果見圖6。

圖6 溫度對對偽三元相圖中微乳區(qū)域面積的影響Fig.6 Effect of temperature on the area of microemulsion region in pseudo-ternary diagram

由圖6可知，制備溫度由20℃變?yōu)?0℃時(shí)，微乳形成區(qū)域增大，可能是因?yàn)榉请x子表面活性劑隨溫度的升高親脂能力增強(qiáng)，較強(qiáng)的親脂能力使得表面活性劑滲透到油相并嵌入到界面中，降低表面張力的能力增強(qiáng)，有利于微乳的形成。所以選擇40℃為制備溫度。

2.3 處方確定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定以Labrafil M 1944CS為油相，PC/EtOH為混合表面活性劑，45 mg/mL的丹酚酸B溶液為水相，固定Km值等于1，實(shí)驗(yàn)溫度40℃，微乳偽三元相圖見圖7。根據(jù)相圖分析，以大豆磷脂、無水乙醇、Labrafil M 1944CS和水相組成的微乳體系最佳質(zhì)量配比為20∶20∶48∶12。

2.4 微乳的鑒定

2.4.1 性狀 空白微乳為淺黃色透明溶液，丹酚酸B微乳為橘紅色透明液體，二者均為流動性好的均相體系。

2.4.2 高速離心 對水—油—表面活性劑分散體系，如果它是外觀透明或近乎透明的，流動性很好的均相體系，并且在100倍重力加速度下分離5 min而不發(fā)生相分離，即可認(rèn)為是微乳液。在1.5 mL離心管中加入1 mL制備的微乳液，放入離心機(jī)中，離心（10000 r/min，5 min），觀察，微乳液保持澄清透明，未見分層，渾濁，沉淀等現(xiàn)象[11]。

圖7 處方組合為Labrafil M 1944CS/大豆卵磷脂/無水乙醇/Sal B 溶液（45 mg/mL）（Km=1）制備溫度為（40±1）℃時(shí)的偽三元相圖。Fig.7 Pseudo-ternary phase diagram of combination of Labrafil M 1944CS/PC/dehydrated alcohol/Salvianolic acid B(45 mg/mL)(Km=1)at ambient temperature of(40±1)℃

2.4.3 稀釋法 微乳能被外相無限稀釋，如加一滴制備的微乳液于水中，立即散開，則為W/O型的微乳，若不能立即散開，浮于水面，則為W/O型的微乳。將空白微乳及丹酚酸B微乳滴入水中，不能分散開；將其滴入Labrafil M 1944CS中，乳液則散開，并能被油相無限稀釋，證明制備的微乳是W/O型。

2.5 微乳的含量測定

2.5.1 溶液的制備 對照品溶液：精密稱取丹酚酸B對照品5.31 mg，加甲醇溶解定容，得濃度為212.4 μg/mL的丹酚酸B對照品母液。供試品的制備：精密稱取丹酚酸B微乳0.5 g于50 mL量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲破乳，再用無水乙醇定容[9]。精密量取1mL上述溶液于10mL量瓶中，加水定容。陰性對照溶液：精密稱取空白微乳，按供試液的配置方法制備陰性對照品溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，進(jìn)高效液相色譜儀檢測。

2.5.2 色譜條件 色譜條件：Agilent ZORBAX SBC18（5 μm，4.6 mm×150 mm）色譜柱，流動相為乙腈-0.3%甲酸（25∶75）（V∶V），流速為 1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為 288 nm，進(jìn)樣量為 20 μL[13]。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取對照品母液適量，加水定容，配制濃度分別為 1.02、5.31、10.62、42.48 及63.72 μg/mL的溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積A對濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=12882C+3486.4，r=0.9999，丹酚酸B在1.02～63.72μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.5.4 精密度回收率 選取低、中、高3個(gè)濃度的對照品，在上述色譜條件下進(jìn)樣，低（5.31 μg/mL）、中（10.62 μg/mL）、高（42.48 μg/mL）3 個(gè)濃度日內(nèi)RSD分別為1.11%，1.78%，1.24%（n=5），日間RSD分別為2.29%，1.99%，1.14%（n=3）。表明精密度符合要求。回收率RSD分別為1.11%，1.78%，1.24%（n=5），符合方法學(xué)要求。

2.5.5 樣品測定 制備3批樣品，按上述色譜條件對進(jìn)行液相測定，結(jié)果見下表。

表1 不同批號微乳中丹酚酸B的含量（n=3）Tab.1 The content of Salvianolic acid B in different batch of micro-emulsion（n=3）

3 討論

偽三元相圖中，丹酚酸B的加入對其影響較大，明顯減小了微乳區(qū)域面積，分析原因可能有以下幾種：1）空白微乳，水相為pH2.0的溶液，溶液中有一定量的氯化鈉（NaCl），而NaCl可以使表面活性劑中有效的極性部分減少，使得表面活性劑和水相之間氫鍵的形成更加困難，使微乳形成增加有難度，由此預(yù)測水相為pH2.0的溶液較水相為去離子水微乳區(qū)稍小。2）丹酚酸B中含有較多的酚羥基，可與水相形成氫鍵，從而減少了表面活性劑和水相之間氫鍵的形成，影響了微乳的形成能力，隨著丹酚酸B濃度加大，酚羥基增多，從而影響微乳的形成。

本研究通過繪制偽三元相圖篩選出了制備水溶性藥物丹酚酸B W/O型微乳所用的油相、表面活性劑、助表面活性劑及影響因素并對其進(jìn)行包載，制得的微乳經(jīng)鑒定為W/O型，證明了丹酚酸B制備成W/O型微乳的可行性，但微乳體系是否具有能夠提高丹酚酸B的小腸黏膜滲透系數(shù)，從而提高口服生物利用度還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

[1] 景春杰，陳曉輝，畢開順，等.丹酚酸B對H2O2引起H9C2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及可能靶點(diǎn)蛋白尋找[J].藥物生物技術(shù),2010，17（2）：105－110.

[2] 甘萍，聶桂麗，李艾珊.丹酚酸B對被動吸煙大鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（3）：130-132.

[3] 高東雁，吳 量，張麗紅，方曉玲，王建新.丹參酚酸口服生物利用度與穩(wěn)定性研究（英文）[A].第三屆國際藥物制劑論壇論文集[C].2007.

[4] Prapaporn B,Karen K,Anja G,et al.Characterization of microemulsion structures in the pseudoternary phase diagram of isopropyl palmitate/water/Brij 97:1-butanol[J].AAPS Pharm-SciTech,2006,7(2):E99-E104.

[5] 徐志彬.水溶性藥物油包水微乳劑的制備工藝研究[D].天津大學(xué)，2006.

[6] 程茂波，金 武，王堅(jiān)成，等.蚓激酶口服微乳的制備及性質(zhì)研究[J].中國新藥雜志，2009，18（1）：78－83.

[7] 岳喜典，曲桂武，李桂生，等.丹參酚酸B在水溶液中穩(wěn)定性的研究[J].中草藥，2005，36（2）：205－207.

[8] 崔正剛.微乳化技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999，87.

[9] 馬金鵬，舒樂新，劉志東.丹酚酸B脂質(zhì)體的制備及其體外釋藥的研究[J].中草藥，2011，42（1）：65－68.