溫補腎陽方對心肌梗死后心力衰竭大鼠血流動力學及血清肌鈣蛋白I和腦鈉肽含量的影響*

劉 茜，周 華，戎靖楓，苑春元，史文靜，黃牧華，王 佩，封 舟，瞿惠燕，王肖龍，郭 蔚，薛金貴

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201203）

心力衰竭（CHF）是由心臟結構性或功能性疾病所導致的一種臨床綜合征，目前中國內(nèi)地成年人CHF的患病率已達0.9%，35～74歲人中約有患者400萬，并呈逐年上升趨勢。CHF伴隨的心臟收縮舒張功能障礙常導致血流動力學改變；體液因子的改變促使腦鈉肽（BNP）水平升高；心肌損害引起血清心肌肌鈣蛋白I（TNI）含量增多。研究[1-3]表明，CHF是一種癥狀性疾病，表現(xiàn)為血流動力學障礙；CHF時存在TNI水平升高，TNI與心力衰竭存在一定關聯(lián)，并可作為診斷CHF新的、有效的手段之一；BNP的增高程度與CHF的嚴重程度呈正相關，可作為評定CHF進程和預后的指標。根據(jù)臨床經(jīng)驗顯示，溫補腎陽方可明顯改善CHF患者的心臟功能。本實驗中，筆者通過觀察溫補腎陽方高、中、低各劑量組對CHF大鼠血流動力學、TNI及BNP的影響，研究其對CHF大鼠的作用機制，為中醫(yī)藥防治CHF提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠60只，購自上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.1.2 藥品和儀器 藥品：鹿角片、仙靈脾、生黃芪、黨參，按 12∶15∶30∶30 組方，將 13.05 kg 生藥水煎兩次，每次1 h，再加10倍量水混勻，藥液過100目不銹鋼篩，90℃濃縮為凈質(zhì)量8.1 kg、密度為1.226浸膏。以上中藥浸膏均由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院制劑室提供。曲美他嗪（片劑），過100目篩后置于雙蒸水，制成1 g/L濃度的曲美他嗪混懸液，由施維雅制藥有限公司提供，批準文號：國藥準字H20055465。大鼠TNI檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），產(chǎn)品批號：DGE20812。大鼠BNP檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），產(chǎn)品批號：DGE20812。電子天平 (METTLER TOLEDO公司)；勻漿機（IKA公司）；PowerLab 8/30生物信號處理和分析系統(tǒng)（ADINSTRUMENTS公司）；Agilent 1200 Series HPLC（Agilent公司）；IKA-werkeTyp VX2E震蕩器（IKA公司）；Direct-Q3純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死后CHF模型的建立 根據(jù)參考文獻[4-5]略作修改，采取結扎大鼠冠狀動脈前降支制備CHF大鼠模型。將雄性清潔級SD大鼠術前禁食禁水12 h，置于浸有乙醚棉球的密閉容器內(nèi)麻醉，仰臥位固定，暴露胸部皮膚，常規(guī)消毒后于心間搏動最強處稍上（第4、5肋間隙）依次剪破皮膚、胸膜，鈍性分離胸肌（術中若大鼠因乙醚揮發(fā)而清醒，立即予吸入少量乙醚），暴露心臟，剪開心包，雙手擠壓胸部，使心臟自行跳出胸腔外，迅速于左冠狀動脈前降支起始點下方約2 mm處進行結扎，結扎完成后使心臟回復至胸腔，層層縫合。術后心電圖（紙速50 mm/秒）以標準導聯(lián)Ⅱ中ST段弓背抬高作為急性心肌梗死形成的標準。假手術組不結扎冠脈，余操作同前。各組大鼠于造模成功2周后留取靜脈血，并行灌胃，10周后再次留取靜脈血，同時監(jiān)測大鼠血流動力學，并開胸留取心肌組織于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組及給藥方法 動物喂養(yǎng)標準合成飼料，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。造模成功后采用隨機數(shù)字表法隨機分組如下：1）模型組。2）假手術組。3）曲美他嗪組。4）溫補腎陽組：低劑量組、中劑量組、高劑量組。每組大鼠各10只（體質(zhì)量250～300 g）。模型組、假手術組：蒸餾水1.0 mL/（kg·d）灌胃。曲美他嗪組：曲美他嗪混懸液1.0 mg/（kg·d）灌胃。溫補腎陽組：高劑量：17.4 g/（kg·d），中劑量：8.7 g/（kg·d），低劑量：4.4 g/（kg·d）。

1.2.3 血流動力學測定 大鼠8周給藥后，禁食禁水24 h，稱取大鼠體質(zhì)量后予肝素鈉1200 U/kg抗凝30 min，以25%烏拉坦2.0 g/kg麻醉，固定后分離右側(cè)頸總動脈，并插入鏈接壓力換能器的PE250型聚乙烯心導管，穩(wěn)定5 min后將導管輕輕送入左心室，經(jīng)PowerLab8/30型生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄大鼠左室舒張壓（LVEDP），左室收縮壓（LVSP），左室內(nèi)壓最大上升下降速率（±LVdp/dtmax）等數(shù)據(jù)。

1.2.4 血清TNI指標測定 分別選用大鼠造模成功后第2周和第10周的靜脈血2.5 mL，于室溫血液自然凝固10～20 min后2500 r/min離心20 min，收集血清。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠TNI濃度。

1.2.5 血清BNP水平測定 分別取大鼠造模后2周和10周的靜脈血2 mL，4℃2500 r/min離心10 min，留取血清。應用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清BNP水平。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0分析軟件，平均值用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

治療前模型組、假手術組、曲美他嗪組以及補腎方低、中、高劑量組各10只。假手術組于造模后7 d死亡1只；曲美他嗪組于2周后死亡1只，補腎方中、高劑量各死亡1只，故進入后續(xù)實驗的大鼠為56只。

2.1 溫補腎陽方對CHF血流動力學的影響 與模型組相比，假手術組、曲美他嗪組和溫補腎陽中、高劑量組大鼠 LVSP、+LVdp/dtmax升高，LVEDP、-LVdp/dtmax降低（P＜0.01），說明曲美他嗪和溫補腎陽中、高劑量能顯著改善左心收縮和舒張功能；與假手術組相比，曲美他嗪組及溫補腎陽低、中劑量組大鼠 LVSP、+LVdp/dtmax降低（P＜0.05 或 P＜0.01），LVEDP、-LVdp/dtmax升高（P＜0.01）；與曲美他嗪組比較，溫補腎陽高劑量組LVSP升高（P<0.01），溫補腎陽低劑量組+LVdp/dtmax降低、LVEDP和-LVdp/dtmax升高（P<0.01）；與溫補腎陽高劑量組相比，溫補腎陽低、中劑量組大鼠LVSP、+LVdp/dtmax降低，LVEDP、-LVdp/dtmax升高（P＜0.05 或 P＜0.01），表明高劑量組改善心肌收縮和舒張功能要優(yōu)于中、低劑量組。見表1。

2.2 溫補腎陽方對CHF大鼠血清TNI的影響 治療前，假手術組大鼠TNI指標明顯低于各組（P＜0.01），說明造模后大鼠心肌明顯受損。治療8周后，模型組大鼠TNI指標較治療前降低，但仍明顯高于各藥物治療組（P＜0.01）。與模型組相比，各治療組大鼠TNI明顯下降（P＜0.01），表明曲美他嗪和溫補腎陽方均可明顯改善心肌受損。與假手術組比較，曲美他嗪及溫補腎陽各劑量組大鼠TNI升高（P＜0.01）。與曲美他嗪組相比，溫補腎陽低、中劑量組TNI升高（P＜0.01）。與溫補腎陽高劑量組相比，溫補腎陽中、低劑量組大鼠TNI均增高（P＜0.01），表明高劑量組降低TNI水平要優(yōu)于中、低劑量組。見表2。

表1 各組大鼠治療后血流動力學變化（±s）Tab.1The changes in hemodynamics of rats in each group after treatment（±s）

表1 各組大鼠治療后血流動力學變化（±s）Tab.1The changes in hemodynamics of rats in each group after treatment（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與曲美他嗪組比較，▲▲P＜0.01；與溫補腎陽高劑量組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）+LVdp/dtmax（mmHg/s）-LVdp/dtmax（mmHg/s）模型組 161.10±20.51 7.58±0.64△△ 14254.71±1214.55 -9347.36± 844.15假手術組 235.14±35.24** 2.42±0.42** 23373.19±4984.02** -16492.09±2658.70**曲美他嗪組 212.43±26.41**△ 3.04±0.44**△△ 20851.33±4012.32** -14803.20±2116.27**溫補腎陽低劑量組 182.85±18.83*△△▲▲☆☆ 4.21±0.41**△△▲▲☆☆ 16014.59±4256.99△△▲▲☆☆ -10687.54±3077.90△△▲▲☆☆溫補腎陽中劑量組 204.43±24.98**△△☆☆ 3.90±0.50**△△▲▲☆☆ 18529.71±1849.98**△△☆ -12696.61±2102.07**△△☆溫補腎陽高劑量組 252.62±24.11**▲▲ 2.92±0.33*△ 21370.29±3141.85** -15158.72±3768.66**

表2 治療前后各組大鼠TNI的變化（±s）Tab.2 The changes in TNI of rats in each group before and after treatment（±s） μg/L

表2 治療前后各組大鼠TNI的變化（±s）Tab.2 The changes in TNI of rats in each group before and after treatment（±s） μg/L

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術組比較，△△P＜0.01；與曲美他嗪組比較，▲▲P＜0.01；與溫補腎陽高劑量組比較，##P＜0.01。

TNI治療前 治療后模型組 1253.91±30.33△△ 960.22±13.71假手術組 538.82±29.60 299.14±52.81**曲美他嗪組 1240.96±27.66△△ 326.15± 4.00**△△溫補腎陽低劑量組 1244.45±31.29△△ 382.80± 4.72**△△▲▲##溫補腎陽中劑量組 1243.37±27.72△△ 364.10± 2.38**△△▲▲##溫補腎陽高劑量組 1241.12±30.42△△ 323.46± 4.43**△△組別

2.3 溫補腎陽對CHF大鼠BNP的影響 治療前，冠脈結扎后大鼠BNP水平明顯高于假手術組，提示大鼠造模2周后心功能明顯下降。治療后，與模型組比較，各治療組大鼠BNP顯著下降（P＜0.01），表明曲美他嗪和溫補腎陽方均可明顯改善CHF大鼠的心功能。與假手術組比較，曲美他嗪及溫補腎陽低、中劑量組大鼠BNP升高（P＜0.01）。與曲美他嗪組相比，溫補腎陽低劑量組BNP升高（P＜0.01）。與溫補腎陽高劑量組相比，溫補腎陽中、低劑量組大鼠BNP均增高（P<0.05或P<0.01），表明高劑量組降低BNP水平要優(yōu)于中、低劑量組。見表3。

3 討論

CHF涉及到中醫(yī)的心痹、心悸、飲證、喘證、水腫等病證范疇。有臨床及實驗研究已證實[6-7]在治療CHF上應強調(diào)心腎相交，心本乎腎，以溫腎求強心。所謂“治心之所以治腎，而治腎之所以治心”。心之陽氣全賴腎陽的資助。腎陽虛可波及于心，引起心陽虛。本病為本虛標示，而本虛以氣虛、陽虛為主。病位雖主要在心，但與腎的關系尤為密切[8]。本方（鹿角片、淫羊藿、黨參、黃芪）來源于周華教授臨床治療慢性CHF經(jīng)驗方益氣溫陽方[9-10]，通過溫補腎陽，溫腎益氣使心陽得到溫煦。本方中含有鹿角片，《本草綱目》曰：鹿角，熱用益腎補虛，強精活血。具有補腎壯陽之功。《吉林中草藥》：鹿角有“補腦、強心”等作用。現(xiàn)代藥理研究顯示，淫羊藿能降低外周阻力，增加冠狀動脈流量，增強心肌收縮力，保護缺血心肌的損害[11]。本方中另含兩味補氣藥以補益心氣達到改善心功能的目的。有報告認為，黃芪有明顯的強心作用；黨參能顯著增加心輸出量，改善心功能。

表3 治療前后各組大鼠BNP的變化（±s）Tab.3 The changes in BNP of rats in each group before and after treatment（±s） μg/L

表3 治療前后各組大鼠BNP的變化（±s）Tab.3 The changes in BNP of rats in each group before and after treatment（±s） μg/L

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與曲美他嗪組比較，▲▲P＜0.01；與溫補腎陽高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

BNP治療前 治療后模型組 506.13±3.62△△ 457.17±19.05假手術組 105.23±3.32 77.29± 1.08**曲美他嗪組 506.72±1.79△△ 84.42± 5.61**△溫補腎陽低劑量組 506.83±2.93△△ 96.25± 2.48**△△▲▲##溫補腎陽中劑量組 507.71±2.23△△ 90.58± 1.62**△△#溫補腎陽高劑量組 506.49±0.91△△ 81.78±5.61**組別

血流動力學障礙是CHF的基本表現(xiàn)。LVSP在一定程度上可以反映心肌收縮力，LVEDP可間接反映左心室功能，LVdp/dtmax是評價心肌收縮性能和舒張功能的指標之一[12]，血液流動性與心臟功能關系密切[13]，本實驗發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪組與溫補腎陽中、高劑量組能使LVES和+LVdp/dtmax明顯升高，并使LVEDP和-LVdp/dtmax降低，其中溫補腎陽高劑量組明顯好于中劑量組。綜合分析可知，溫補腎陽方（尤其是高劑量組）和曲美他嗪均可改善心臟收縮和舒張功能，對改善CHF的發(fā)生發(fā)展有著重要的意義。TNI是肌原纖維ATP酶的抑制性亞單位，可松弛心肌，是心肌特有的抗原。目前認為肌鈣蛋白可作為心肌損傷的指標。有研究[14]顯示，TNI升高預示著心肌重構和心功能降低，監(jiān)測CHF患者血清TNI濃度并采取相應的措施降低其水平，對臨床治療和預防CHF進展具有重要意義。本實驗中，溫補腎陽各劑量組（尤其是高劑量組）與曲美他嗪組均能顯著降低TNI水平。由此可見，溫補腎陽方可明顯改善心肌損傷。BNP主要儲存于心室肌內(nèi)，能擴張血管、增加排鈉，對抗腎上腺素和RAS的水鈉潴留。CHF時，心室分泌BNP參與體液調(diào)節(jié)，具有很好的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用[15]，是評價心功能紊亂最敏感和特異性最高的指標之一，可用于CHF的診斷和治療[16]。本實驗，灌胃治療8周后，溫補腎陽方各劑量組（尤其是高劑量組）及曲美他嗪組均能明顯降低CHF大鼠的BNP水平。通過此研究可以得出以下結論：溫補腎陽方在改善CHF心肌收縮舒張功能、受損以及心臟功能等方面有一定的療效，尤其是溫補腎陽方高劑量組。因此，溫補腎陽方在CHF的進展過程中可能起到一定的防治作用，其前景廣闊。

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