丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導因子（AIF）表達及神經元凋亡的影響

羅德云

（攸縣中醫(yī)院，湖南 株洲 412300）

丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導因子（AIF）表達及神經元凋亡的影響

羅德云

（攸縣中醫(yī)院，湖南 株洲 412300）

目的 探究丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導因子（AIF）表達及神經元凋亡的影響。方法 將21只Wistar大鼠隨機分成三組：甲、乙、丙，其中甲組為假手術組，乙組為局灶性腦缺血再灌注組，丙組則為丹紅注射液治療組，之后采用改良線栓法來建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，甲乙丙三組都在1、3、5d之后對大鼠腦組織進行AIF及神經元凋亡變化的測定。結果 丙組大鼠腦組織AIF及神經元的凋亡在造模后的1、3、5d都明顯要低于甲乙組（P＜0.05），可見差異具有統(tǒng)計學意義。結論 本研究顯示，利用丹紅注射液能有效抑制AIF的表達，從而減少神經元的凋亡，由此可見其對于大鼠腦缺血再灌注有著積極的保護作用。

丹紅注射液；腦缺血再灌注；凋亡誘導因子；AIF；神經元凋亡

目前，嚴重危害人類健康的疾病中有一種缺血性腦血管病，而腦缺血損傷病理生理過程十分復雜，當前依然在不斷探索之中[1]。隨著科技不斷進步，再灌注損傷導致的神經元凋亡已普遍受到了廣泛關注，而如何減少再灌注損傷也成為了治療急性缺血性卒中的重要工作。本研究以Wistar大鼠作為研究對象，進行了丹紅注射液對腦缺血再灌注后凋亡誘導因子（AIF）表達及神經元凋亡的影響的研究，取得了良好的效果。現(xiàn)將相關結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 資本資料

實驗動物：21只Wistar大鼠，體質量在250～330g，平均為275.9g；年齡在3～4個月間，平均為3.4個月。全部由我省總醫(yī)院實驗動物中心所提供，大鼠之間的一般資料差異性不大，因此具有可比性。藥物與試劑：丹紅注射液、AIF兔多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒。

1.2 基本方法

隨機將21只Wistar大鼠隨機分成三組：甲、乙、丙，其中甲組為假手術組，乙組為局灶性腦缺血再灌注組，丙組則為丹紅注射液治療組。丙組給予丹紅注射液5mL/kg，在手術之前30min進行腹腔注射，每日進行一次，連續(xù)注射5d。乙組則給予等量的生理鹽水。

1.3 動物建模

模型制作參照Nagasawa等[2]的改良線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血模型。采用水合氯醛腹腔對大鼠進行注射麻醉，將其采用仰臥固定，分離其右側的頸總動脈、頸內動脈與頸外動脈，同時將其頸總動脈與頸外動脈結扎，利用動脈夾夾閉頸總動脈，迅速在頸內動脈和頸外動脈分叉的下方剪一個切口，利用預先燒成圓頭的尼龍線插入頸內動脈（深度控制在18.55毫米左右），當有輕微阻力感，便可實現(xiàn)大腦中動脈阻塞以此形成腦缺血。之后，做好相關后續(xù)工作，比如結扎與縫合等。

1.4 AIF免疫組化標記

AIF免疫組化標記采用的是SABC法：將石蠟切片脫蠟至水，之后放進檸檬酸鹽緩沖液中，用微波熱進行修復15min左右，將其利用濃度為3%的雙氧水進行室溫孵育10min，進而利用濃度為10%的山羊血清封閉，再進行室溫孵育10min，然后將血清傾去（不洗），滴加1∶200的兔抗鼠AIF抗體，在4℃的冰箱里過夜孵育，之后進行37℃復溫1h，滴加適量的生物素將羊抗兔二抗工作液進行標記，采用37℃孵育15min。除封閉血清外，其余步驟皆采用PBS沖洗3次，每次5min左右。之后獲得相關樹膠封片，利用顯微鏡進行觀察分析。最后根據(jù)TUNEL試劑盒提供的相關試驗步驟進行操作，以對凋亡細胞進行檢測，從而獲取本研究所需相關數(shù)據(jù)結果。

1.5 統(tǒng)計學方法

本研究相關數(shù)據(jù)采用SPSS.12.0統(tǒng)計學軟件進行相關統(tǒng)計與分析，相關數(shù)據(jù)采用均數(shù)及標準差（）表示，并采用t檢驗來檢測差異性，以P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 AIF表達

AIF陽性細胞呈現(xiàn)出的是棕黃色，在甲組中并為見到明顯的AIF陽性細胞；乙組與丙組在缺血再灌注1d后，皆呈現(xiàn)出了陽性細胞高峰（但差異性顯著，詳見表1），之后下降；通過統(tǒng)計學分析，可知乙組與丙組在同等時間內差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 乙組與丙組大鼠缺血再灌注后AIF陽性細胞表達對比（）

表1 乙組與丙組大鼠缺血再灌注后AIF陽性細胞表達對比（）

組別例數(shù)I/R 1dI/R 3dI/R 5d乙組7125.36±9.0783.23±8.8953.89±6.12丙組792.90±7.4975.01±7.3647.06±5.87 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.2 凋亡細胞檢測

TUNEL檢測凋亡細胞，其熒光顯微鏡顯示為綠色，DAB顯色之后，出現(xiàn)了棕黃色顆粒者則為凋亡細胞，而正常的細胞核則無著色，主要存在缺血周圍區(qū)，而甲組沒見到明顯的陽性細胞；乙組與丙組在缺血再灌注1d后，TUNEL凋亡細胞達到了高峰（存在明顯的差異性，詳見表2），之后下降；乙組與丙組進行對比分析可知，在同等時間內差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

神經元的凋亡在腦缺血再灌注繼發(fā)的神經損傷機制中有著十分重要的作用，因此利用神經元凋亡的抑制來防治腦缺血再灌注繼發(fā)神經元損傷已經成為了當下研究的一大熱點。總的來說，細胞的凋亡屬于一個十分復雜的過程，涉及到了酸中毒、能量衰竭、細胞內鈣離子的超載等。AIF屬于這些年才發(fā)現(xiàn)的一類凋亡效應分子，屬于一種進化較為保守的黃素蛋白，一般在細胞線粒體膜間隙中，有著凋亡誘導的活性。AIF屬于雙功能蛋白，有著氧化還原酶的活性，同時也與線粒體的相關生理活動有著莫大的關聯(lián)[3]。而丹紅注射液屬于當前最為常見的臨床藥物，主要成為包括了、紅花黃色素與丹參等，采用的是中藥紅花與丹參科學提取精煉而成。本研究顯示，利用丹紅注射液能有效抑制AIF的表達，從而減少神經元的凋亡，由此可見其對于大鼠腦缺血再灌注有著積極的保護作用。

表2 乙組與丙組在大鼠缺血關注后的TUNEL凋亡細胞對比（）

表2 乙組與丙組在大鼠缺血關注后的TUNEL凋亡細胞對比（）

組別例數(shù)I/R 1dI/R 3dI/R 5d乙組7102.44±9.1377.10±8.0945.79±5.62丙組781.68±8.5767.59±5.7940.59±4.35 P值＜0.05＜0.05＜0.05

[1] 王彥平,楊金升,石向群,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡誘導因子的表達與神經元凋亡的關系[J].中華神經醫(yī)學雜志,2010, 9(6):263-264.

[2] 王彥平,楊金升,范磊.丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注后凋亡誘導因子的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2010,8(6):412-413.

[3] Chen ZQ,Hong L,Wang H.Effect of danhong injection on platelet activation and inflammatory factors in patients of acute coronary syndrome after intervention therapy[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2009,29(8):692-294.

[4] 王彥平,楊金升,范磊.艾芬地爾對腦缺血再灌注大鼠AIF表達及神經元凋亡的影響[J].卒中與神經疾病,2010,17(2):315-316.

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1671-8194（2013）19-0097-02