高同型半胱氨酸對小鼠足細胞CD2AP表達的影響

張曉亮 柳 潔* 馬春明 張姬欣 高 穎

（山西醫科大學，山西 太原 030012）

高同型半胱氨酸對小鼠足細胞CD2AP表達的影響

張曉亮 柳 潔* 馬春明 張姬欣 高 穎

（山西醫科大學，山西 太原 030012）

目的 觀察α-硫辛酸對高同型半胱氨酸（Hcy）作用下小鼠足細胞胞CD2AP mRNA表達的影響，探討α-硫辛酸對足細胞的保護作用。方法 將體外培養的足細胞分為正常組、Hcy組、Hcy+α-硫辛酸組，培養24、48、72h時分別收集細胞，RT-PCR法檢測CD2AP mRNA表達。結果 Hcy組，足細胞CD2AP mRNA表達自24h開始下調（P＜0.05），且有一定的時效性，72h達到下調高峰（P＜0.01）；Hcy+α-硫辛酸組，48h時，CD2AP mRNA表達較Hcy組增高（P＜0.05），72h仍有上述差異（P＜0.05）。結論 α-硫辛酸對足細胞有一定的保護作用，可能與其可對抗高同型半胱氨酸下CD2AP mRNA表達下調有關。

同型半胱氨酸；足細胞；α-硫辛酸；Nephrin

近年來，同型半胱氨酸（Hcy）作為一種血管反應性氨基酸，其在糖尿病微血管并發癥中的作用越來越受到大家的關注，隨著對足細胞的研究和認識逐漸深入，足細胞裂孔隔膜蛋白表達異常在糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）發病中的重要作用被逐漸認同，CD2AP作為裂隙孔膜蛋白的重要組成，其表達異常可導致足細胞裂孔隔膜的完整性被破壞，濾過屏障功能受損，直接影響DN的發生發展。本研究通過觀察α-硫辛酸對高Hcy環境下足細胞CD2AP mRNA表達的影響，探討α-硫辛酸對足細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠足細胞（復旦大學細胞中心）；RPMI1640細胞培養液（美國Hyclone公司）；無支原體胎牛血清FBS（杭州四季青生物有限公司）；含EDTA胰酶（美國Hyclone公司）；青鏈霉素（北京Solarbio公司）；小鼠γ-干擾素（美國Peprotech公司）；Hcy和α-硫辛酸（美國Sigma公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；引物由上海生物工程技術有限公司合成。超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司）；HF90/HF24二氧化碳培養箱（上海力申科學儀器有限公司），7300 Real Time PCR System、PCR System 9700（美國ABI公司）；FC500流式細胞儀（美國貝克曼公司）。

1.2 細胞培養

細胞培養 足細胞培養方法參考 Mundel等[1]，細胞于含50 U/mLγ-干擾素，100U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，10%（體積分數）胎牛血清的1640培養液中，在33℃細胞培養箱中培養傳代。然后將細胞轉入不含γ-干擾素的10%胎牛血清1640培養液，37℃細胞培養箱中誘導分化10～14 d后使用。分化成熟的細胞于不含胎牛血清的1640培養液中同步培養24h，根據不同的實驗目的分組：正常組（等體積1640培養基）、高Hcy組（1mmol/L的Hcy）、混合組（1mmol/L的Hcy+0.5mmol/Lα-硫辛酸）。

1.3 Nephrin mRNA表達測定

按上述方法培養的細胞，分別于培養24、48、72h收集細胞，抽提細胞總RNA以RT-PCR半定量方法測定podocin mRNA表達, 引物序列見表 1。反應結束后，RT-PCR相對定量結果采用2- △△ CT法：ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。所有操作均按試劑盒說明書進行。見表1。

表1 RT-PCR測定引物RT-PCR testprimer sequence

1.3 統計學處理

每個實驗設6個復孔，所有數據經SPSS13.0統計軟件進行處理，計量資料進行正態性檢驗后，統計結果以均數+標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

各組CD2AP mRNA表達如表1所示，與對照組相比，Hcy組及混合組CD2AP mRNA表達自24h開始呈下調趨勢（P＜0.05），72h尤其明顯（P＜0.01）；48h時混合組CD2AP mRNA較Hcy組表達增多（P＜0.05），72h仍有上述差異，說明α-硫辛酸可對抗高Hcy對CD2AP mRNA表達的下調作用。見表2。

表2 各組Nephrin mRNA表達變化（%，，n=6）

表2 各組Nephrin mRNA表達變化（%，，n=6）

注：以正常葡萄糖組作為對照組，其他各組分別作為實驗組，由于計算而得的相對倍數均＜1，將結果以百分數形式進行統計，以正常對照組作為100，其余各組分別與對照組進行兩獨立樣本t檢驗，與正常對照組相比，*表示P＜0.05；與同組24h相比，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與同組48h相比，▲表示P＜0.05：與高Hcy組相比，#表示P＜0.05

組別時間24h48h72h高Hcy組46.83±3.26*28.07±0.93*△16.44±1.44*▲混合組41.06±4.11*36.79±1.89*△#25.36±1.57*▲△△#

3 討 論

Hcy是一種反應性血管損傷氨基酸，近年來研究表明，Hcy不僅是心、腦血管疾病的獨立危險因素，其與糖尿病微血管并發癥的發生、發展也存在一定的關聯。有文獻報道[2]，高Hcy血癥是DN 的危險因素。高Hcy 可通過促進活性氧過多產生致氧化應激激活多元醇、晚期糖基化終末產物（AGE）、PKC、己糖途徑導致腎臟損傷，加速DN的進程[3]。本研究顯示，高Hcy可下調足細胞CD2AP mRNA表達，且有一定的時效性，與上述報道一致。硫辛酸是一種強效的抗氧化劑，可清除包括氫氧自由基、單態氧、一氧化氮自由基、氫過氧化物等在內的多種氧化應激產物，維持機體正常的抗氧化水平。有研究發現[4]α-硫辛酸可抑制氧化應激所引起的核轉錄因子-κB信號通路的激活，從而減輕系膜細胞的增殖。α-硫辛酸能降低DN患者血漿中Hcy的水平，改善血管內皮功能，從而延緩糖尿病腎病的進展[5]。本研究還顯示，48h時，混合組CD2AP mRNA表達較高同型半胱氨酸組增高，72h時仍有此差異，因此推測α-硫辛酸可對抗高Hcy對CD2AP mRNA的下調作用，可能與其抗氧化應激有關。

綜上所述，高Hcy可下調足細胞CD2AP mRNA表達，α-硫辛酸可對抗此下調作用，但其具體作用機制仍需進一步研究。

[1] Mundel P,Reiser J,Zú?iga Mejía Borja A, et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines [J]. Exp Cell Res,1997,236(1):248-258.

[2] 李計元.同型半胱氨酸與血管疾病[J].醫學綜述,2008,14(5):712-714.

[3] 魏劍芬,程燕.糖尿病腎病患者血清同型半胱氨酸與氧化應激的關系[J].天津醫藥,2008,38(10):871-873.

[4] 李慧,賈一韜,韋多,等.α-硫辛酸對高糖誘導的系膜細胞核因子-κB活性的抑制作用[J].解放軍醫學雜志,2006,31(11):1074-1076.

[5] 孫麗,陳亙卓,劉麗,等.α-硫辛酸對2型糖尿病腎病患者高同型半胱氨酸血癥及血管內皮功能的影響[J].中國醫藥指南,2011,9(27):223-224.

Effects of Alpha-lipoic Acid on the Expression of CD2AP in Mouse Podocytes Cultured in Homocysteine Environment

ZHANG Xiao-liang, LIU Jie, MA Chun-ming, ZHANG Ji-xin, GAO Yi
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030012, China)

Objective To observation the effect of the alpha-lipoic acid on the expression of CD2AP mRNA in mouse podocytes cultured in homocysteine environment,To explore the protective effects of alpha-lipoic acid on podocyte. Methods The podocytes were cultured in high homocysteine and alphalipoic acid environment and collected respectively at 24、48、72h, the mRNA expression of CD2AP was examined by RT-PCR. Result The expression of CD2AP mRNA was decreased, and there is a certain timelines, alpha lipoic acid can resist the trend. Conclusion Alpha lipoic acid has protective effect on podocytes, and it can resist down-regulating the expression of CD2AP mRNA.

Alpha lipoic acid; Homocysteine; Podocyte; CD2AP

R54

B

1671-8194（2013）19-0069-02

*通訊作者：E-mail： liujie6@medmail.com.cn