Se（Ⅳ）對赤子愛勝蚓Sb（Ⅲ）中毒的拮抗作用

梁淑軒，王凱，耿夢嬌，李璠

（河北大學化學與環境科學學院，河北保定 071002）

Se（Ⅳ）對赤子愛勝蚓Sb（Ⅲ）中毒的拮抗作用

梁淑軒，王凱，耿夢嬌，李璠

（河北大學化學與環境科學學院，河北保定 071002）

為研究Se（Ⅳ）的加入是否能夠緩解蚯蚓體內Sb（Ⅲ）毒性，且闡述蚯蚓體內Se（Ⅳ）與Sb（Ⅲ）的相互作用.實驗將蚯蚓置于不同含量Se（Ⅳ）與Sb（Ⅲ）供試土壤中，分別在不同暴露時間后取出蚯蚓，用ICP－MS測量蚯蚓體內Se（Ⅳ）與Sb（Ⅲ）含量.通過研究表明，高含量Se（Ⅳ）對Sb（Ⅲ）首先表現為協同作用，隨著暴露時間推移，Se（Ⅳ）對Sb（Ⅲ）起到了解毒作用.適量Se（Ⅳ）（2～10mg／kg）在一定程度上能緩解金屬Sb（Ⅲ）對蚯蚓的毒害，且隨著Se（Ⅳ）含量增加，蚯蚓體內起到解毒作用的時間也由4d縮短到2d.

蚯蚓；Se（Ⅳ）；Sb（Ⅲ）；拮抗作用；協同作用

許多研究證明Sb（Ⅲ）對人體及生物具有慢性毒性及致癌性，且Sb（Ⅲ）及其化合物被美國環保局及歐盟列為優先污染物［1］.Se（Ⅳ）對動物及人體來說是一種必需的生命元素［2］，在低含量條件下能夠作為一種抗氧化劑來降低氧化脅迫對動植物產生的危害，而在高濃度下，它卻是一種氧化強化劑［3－4］.另外，Se（Ⅳ）也是一種解毒劑，能夠降低許多對植物有害元素的毒性［5－8］.

當多種元素同時進入生物體內時，引起的生物毒性效應與這些元素在生物體內的聯合作用有關.Se（Ⅳ）作為帶負電荷的非金屬離子，在生物體內可以與帶正電荷的有害金屬離子相結合，形成金屬－硒－蛋白質復合物，起到解毒排毒作用，從而保護生物體的生理系統［9］，這實質上是Se（Ⅳ）本身改變了金屬對生物大分子活性點位（生物活性點位是生物大分子中具有生物活性的基團和物質）的親和力，而使這些金屬轉移到對生物生理和代謝有利的位置上.

生物體內諸多元素之間存在著拮抗和協同關系，對于這種極其復雜的關系，國內外開展了很多研究，但以Se（Ⅳ）對重金屬脅迫植物抗性的研究為主，動物研究報道為輔.為研究各元素在動物體內的相互關系，本文選擇Se（Ⅳ）和Sb（Ⅲ）這2種有益和有害的元素，利用土培法，研究這2種元素在蚯蚓體內的相互作用.通過研究蚯蚓體內Se（Ⅳ）與Sb（Ⅲ）的變化規律，為了解各元素在生物體內的毒害作用及其解毒機制提供依據.

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）由天津賈立明蚯蚓養殖有限公司提供，挑選環帶明顯、體態相似的健康成蚓進行實驗.

1.2 儀器與試劑

PHB－10型筆式pH計（上海虹益儀表儀器有限公司）；MARS X press微波消解儀（美國CEM公司）；BHW－09C趕酸儀（上海博通化學科技有限公司）；X series2型電感耦合等離子體質譜（ICP－MS）儀（賽默飛世爾公司）.

一次去離子水（由Molecular超純水裝置制備），0.1mol／L的K2Cr2O7溶液，FeSO4溶液，鄰菲啰啉指示劑，Sb（Ⅲ）標準溶液（國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院），酒石酸銻鉀（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），亞硒酸鈉（分析純，天津市華東化學試劑廠），Se（Ⅳ）標準溶液（國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院），濃硝酸（MOS級，北京化學試劑研究所），高氯酸（分析純，天津市鑫源化工有限公司）.

1.3 培養基

供試土壤采自河北省保定市河北大學校內（0～15cm）.土壤主要理化性質如下：土壤pH為8.25，V（土）∶V（水）＝2∶5，土壤含水量為11%（質量分數），通過稀釋熱法測得土壤有機碳為12.18g／kg，土壤有機質為21.00g／kg.供試土壤中總Sb（Ⅲ）未檢出，總Se（Ⅳ）為2.36μg／kg.

2 實驗方法

2.1 實驗設計

將風干的供試土樣過篩，選取規格為30cm×15cm×20cm的玻璃缸洗凈晾干，每個缸中放置2kg土，然后在缸中加入100mL標準溶液，分成6組（每組平行3次）.本實驗質量濃度設置如表1所示.

表1 實驗設計Tab.1 Experimental design

2.2 蚯蚓的染毒和取樣

將用去離子水清洗干凈的赤子愛勝蚓置于裝有污染土壤的玻璃缸中飼養，實驗期間保持室內溫度18～24℃，分別在12，24，48，96，168h各取4條，用水沖洗干凈，置于采樣袋中使之排泄.

2.3 蚯蚓體內重金屬含量的測定

將排泄10h后的蚯蚓取出，用蒸餾水洗凈，拭干后準確稱重，冰凍致死，于烘箱中80℃烘4h，冷卻后研磨，過180目（孔徑0.088mm）篩，制成粉備用.

稱取適量蚯蚓粉末于聚四氟乙烯消解罐中，加20mL濃硝酸靜置過夜后加入5mL高氯酸，放于消解儀中按表2所設置的升溫程序進行消解，消解完畢后趕酸，冷卻后加1mL濃硝酸和少量水，轉入50mL的比色管中，定容后過濾［10］.與此同時做樣品空白，然后采用ICP－MS（儀器參數如表3）測定其體內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）含量.

表2 微波消解儀的工作條件Tab.2 Optimal parameters of microwave digestion

3 結果與討論

3.1 儀器工作條件的選擇

使用調諧液調整儀器各項指標，使儀器靈敏度、分辨率等各項指標均達到測試要求.

ICP－MS選用Xt標準模式時，由于Se（Ⅳ）的高電離性質，決定了此方法具有很高的靈敏度，但對于Se（Ⅳ）來說豐度較大的幾個同位素又不能用質譜來檢測，因為其干擾嚴重，而使用幾乎無干擾的82Se（Ⅳ）檢測，其天然豐度又較低（9.2%），因此與其他元素相比，較難測定［11］.所以在本次實驗當中，在確定實驗的相對標準偏差小于5%下，改變儀器的采集時間，發現采樣時間在2.5s時，Se（Ⅳ）的干擾最小，實驗的準確度與靈敏度可達到最佳.選定的ICP－MS儀器工作參數列于表3.

表3 ICP－MS的工作條件Tab.3 Operating parameters of ICP－MS

3.2 測定方法的線性以及回收率

分別配制1～100μg／L線性內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）標準溶液，結果測得Sb（Ⅲ）和Se（Ⅳ）標準曲線的相關系數分別為0.999 948，0.999 981.在樣品中分別加入5，10μg／L 2個質量濃度的Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）標準品，測得該方法的平均回收率為88.4%～112.6%，RSD均在5%之內.說明該測定方法準確可靠.

3.3 土壤中不同質量分數的Se（Ⅳ）對蚯蚓體內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）含量影響

實驗分別在不同暴露時間下取不同質量的蚯蚓進行處理，并選用表3中ICP－MS的工作條件同時測定處理樣品中Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）含量，所得結果如圖1所示.

圖1 不同質量濃度Se（Ⅳ）處理下蚯蚓體內Se（Ⅳ）與Sb（Ⅲ）含量的變化Fig.1 Changes of Sb（Ⅲ）and Se（Ⅳ）in earthworm with different mass concentrations of Se（Ⅳ）

由圖1可以看出，12h時，蚯蚓體內Se（Ⅳ）含量隨土壤中Se（Ⅳ）含量的增加呈現上升趨勢，而蚯蚓體內Sb（Ⅲ）含量趨于平穩，說明在12h時，Se（Ⅳ）對Sb（Ⅲ）并未起到解毒作用.12h后蚯蚓體內Se（Ⅳ）隨土壤中Se（Ⅳ）含量的增加基本趨于穩定，而Sb（Ⅲ）的含量則存在一個臨界點，說明在此臨界點之前，蚯蚓體內Se（Ⅳ）與Sb（Ⅲ）呈現的是協同作用，超過臨界點，隨著土壤中Se（Ⅳ）含量的推移對蚯蚓體內Sb（Ⅲ）起到抑制作用，有研究表明這些作用與形成金屬配位體的結合態有關，故明顯地呈現出金屬與非金屬間的拮抗作用［］.

12h后Se（Ⅳ）對Sb（Ⅲ）脅迫下蚯蚓的生長產生了影響，其生物效應與含量的關系遵循Weinberg原理，即低含量Se（Ⅳ）能夠減少蚯蚓體內Sb（Ⅲ）含量，高含量Se（Ⅳ）則能促進蚯蚓對Sb（Ⅲ）的吸收，當Se（Ⅳ）的含量處于一定范圍時，對蚯蚓體內Sb（Ⅲ）起到了很好的解毒作用，這與吳永堯［13］研究水稻的結果一致.本研究表明，當Se（Ⅳ）處于一個較低水平（低于2mg／kg）或者較高水平時（高于10mg／kg），蚯蚓體內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）呈現協同作用；而當Se（Ⅳ）的質量分數處于一定水平時（2～10mg／kg），蚯蚓體內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）呈現拮抗作用，在此范圍內，Se（Ⅳ）對蚯蚓體內的Sb（Ⅲ）起到解毒作用.

3.4 不同的暴露時間下蚯蚓體內Sb（Ⅲ）／Se（Ⅳ）質量比值的變化

同一含量下，不同的暴露時間對蚯蚓體內Sb（Ⅲ）／Se（Ⅳ）質量比值的變化如圖2所示.

如圖2所示，在未加入Se（Ⅳ）的土壤中飼養蚯蚓，蚯蚓體內Sb（Ⅲ）／Se（Ⅳ）值隨著暴露時間推移呈現持續上升趨勢，說明隨著時間推移，蚯蚓體內自身的Se（Ⅳ）并不足以抵御外來源Sb（Ⅲ）的侵入使得Sb（Ⅲ）在蚯蚓體內積累.

當土壤中Se（Ⅳ）質量分數為1～5mg／kg時，在最初4d時間里，Se（Ⅳ）并未減弱Sb（Ⅲ）對蚯蚓的毒害，蚯蚓體內Sb（Ⅲ）／Se（Ⅳ）值升高.然而4d之后，蚯蚓體內Sb（Ⅲ）／Se（Ⅳ）值呈現下降趨勢，在此時間段內這2種元素在蚯蚓體內呈現出了拮抗作用.這可能是由于在初始階段由于Sb（Ⅲ）的吸附能力比Se（Ⅳ）強，所以在蚯蚓體內相互競爭進入細胞中，并起到了毒害作用.隨著時間推移，Se（Ⅳ）結合在細胞上，然后被損害的細胞所利用，起到了解毒作用，這可能就是Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）起到了拮抗作用.

當土壤中Se（Ⅳ）的質量分數為5～20mg／kg時，Se（Ⅳ）從第2天開始就對蚯蚓體內的Sb（Ⅲ）起到了解毒作用，在這個時間后，這2種元素在蚯蚓體內是拮抗作用.總之，隨著暴露時間的增長，Sb（Ⅲ）的質量分數較空白對照減少19.6%～89.7%.而且隨著土壤中Se（Ⅳ）含量的增加，Se（Ⅳ）對蚯蚓開始起解毒作用的時間也在發生變化，由之前4d縮短到2d.

圖2 不同暴露時間下，蚯蚓體內m（Sb）／m（Se）值Fig.2 m（Sb）／m（Se）value of earthworm body after different exposure period

綜上所述，當Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）同時存在時，它們在蚯蚓體內的相互作用是拮抗與協同并存.有研究表明，當2種元素同時存在，首先進入的元素吸附到細胞壁上，此時細胞壁形成一個酸性結合部位，之后這2種元素在此結合部位相互競爭，這種物理化學過程解釋了元素之間的拮抗作用，但目前還沒有機理能很好解釋元素之間的協同作用［14－15］.

4 結論

通過以上實驗發現，Se（Ⅳ）對Sb（Ⅲ）脅迫下蚯蚓的生長產生了影響，其生物效應與含量的關系遵循Weinberg原理，即當Se（Ⅳ）質量分數處于一個較低水平（低于2mg／kg）或者較高水平時（高于10mg／kg），蚯蚓體內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）呈現協同作用；而當Se（Ⅳ）質量分數處于一定水平時（2～10mg／kg），蚯蚓體內Sb（Ⅲ）與Se（Ⅳ）呈現拮抗作用，在此范圍，Se（Ⅳ）對蚯蚓體內Sb（Ⅲ）起到解毒作用.

隨著暴露時間推移，蚯蚓體內Sb（Ⅲ）含量減少，相對減少19.6%～89.7%.而且隨著土壤中Se（Ⅳ）含量的增加，Se（Ⅳ）在蚯蚓體內起到解毒作用的時間縮短，由4d縮短到2d.

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（責任編輯：梁俊紅）

Antagonistic effect of Se（Ⅳ）on the Eisenia foetida against Sb（Ⅲ）

LlANG Shuxuan，WANG Kai，GENG Mengjiao，Ll Fan
（College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

Detoxication effect of selenium on antimony in earthworms（Eisenia Foetida）body was investigated in this study.The interaction of selenium and antimony of different dosages in earthworms was determinatied.The earthworms were breed in artificial soil with different concentration of selenium and antimony after 12hours to 7days.The whole earthworm was freezed to death and grinded into powder samples respectively.The sample concentration of selenium and antimony was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP－MS）.The results revealed that selenium alleviated the toxicity of antimony obviously in suitable concentration.High levels of selenium were synergy on antimony，but with the extension of exposure time，selenium also showed the detoxification effect.The antagonistic effect was obvious when selenium concentration was in the range of 2to 10mg／kg.With the increasing of the selenium concentration，the detoxification time in earthworms was shortening from 4dto 2d.

Eisenia foetida；selenium；antimony；antagonism；synerg y

X174

A

1000－1565（2013）03－0264－06

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.03.008