胃蛋白酶－胰蛋白酶兩步體外消化法評定豆粕粉碎粒度

梁 明 楊維仁

(山東農業大學，泰安 271018)

飼料粉碎粒度對飼料消化利用和動物生產性能均有明顯影響，對飼料的加工過程與產品質量也有重要作用［1］。粉碎過程通過破壞谷物種皮的保護，從而增大了飼料的表面積，增加了飼料與消化酶接觸的機會，進而提高養分的消化利用率，改善飼料報酬。適宜的粉碎粒度可顯著提高飼料的轉化率，減少動物糞便排泄量，提高動物的生產性能，也利于飼料成分混合均勻，便于顆粒飼料的制作，提高制粒的效率和顆粒質量［2］。近年來對畜禽飼料粉碎粒度的研究，表明了粉碎粒度與制粒和畜禽生產性能的重要關系，各種畜禽的最適粉碎粒度的評定是粒度研究的關鍵［3］。

飼料粒度的測定方法目前主要有篩上物留存百分率法(兩層篩法)［4］、幾何平均粒度法(十四層篩法)、細度－均勻度模數法(七層篩法)［5］。其中十四層篩分法測定和計算雖然麻煩，但結果科學精確［6］。

飼料粉碎粒度的評定一般利用動物對飼料原料的消化率狀況衡量。消化率的研究方法主要有體內消化法和體外消化法。體內法耗資、費力、效率低、重演性、可比性差，同時測值又受到種種條件限制［7］，體外法相對簡單，快速，重復性好［8］。胃蛋白酶－胰酶兩步體外消化法是目前公認的一種較好的測定蛋白質消化率的方法［9］。當前對飼料粉碎粒度的研究主要集中在玉米、小麥和高梁上［10－13］，對豆粕的研究不是很多。且現在對粉碎粒度的體外評定主要為單一原料粉碎粒度的研究，未發現對不同粉碎粒度原料制成配合飼料的體外研究。本試驗通過胃蛋白酶－胰蛋白酶兩步消化法測定不同粒度豆粕及不同粒度基礎配制的粉狀配合飼料、顆粒料的干物質和蛋白質的消化率，研究豆粕的最適粉碎粒度，探討豆粕粉碎粒度與豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試驗儀器

SFP－ZY多腔高效多功能粉碎機:唐山雙義飼料機械;粉碎篩片(直徑 1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm、2.5 mm、3.0 mm);SZLH420 －150 制粒機:江蘇溧陽正申機械;標準篩一套(直徑200 mm);頂擊式振篩機:浙江上虞五金紗織篩廠;恒溫水浴振蕩器、真空泵、布氏漏斗等。

1.2 商品酶

胃蛋白酶(活性1∶3000):北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司;胰蛋白酶(活性2 500 u/mg):阿拉丁化學有限公司;緩沖液:pH 1.4，0.05 mol/L，HCl－KCl緩沖液;pH 6.8，0.05 mol/L，KH2PO4－ NaOH 緩沖液。

1.3 試驗待測樣品

豆粕:水分(12 ±0.1)%，直徑為 1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mm篩孔孔徑的篩片粉碎獲得。

粉狀配合飼料、顆粒料:按照配方(表1)配料、混合，用壓縮比1∶10、環模孔徑3.2 mm的環模加工制粒。

表1 試驗日糧配方組成

1.4 方法與測定

1.4.1 基礎指標的測定

水分按GB/T 6435—2006進行。粒度按照GB 6971—1986《飼料粉碎機試驗方法》進行。蛋白質、干物質以半微量凱氏定氮法及105℃烘干法測定飼料原料及消化處理后的飼料樣品的含氮量及干物質含量。

1.4.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶最適濃度的確定［14－16］

1.4.2.1 胃蛋白酶最適酶量的選擇

準確稱取5份0.5 g豆粕(過40目)于250 mL培養三角瓶中，加入 pH 1.4 的0.05 mol/L HCl－ KCl緩沖液30 mL。每個三角瓶加入含不同胃蛋白酶活性單位(10、30、50、70、90 mg/mL 的 HCl－ KCl緩沖液配置)的溶液各1 mL，再加入0.5 mL細菌生長抑制劑(0.5%的氯霉素)，蓋上橡膠塞，將三角瓶置于(37±0.1)℃臺式恒溫搖床(恒溫水浴振蕩器)中，以其溫度達到37℃開始計時，振蕩(80次/min)3 h。

使用真空泵和布氏漏斗進行抽濾(過濾前，濾紙須稱重，鉛筆標號)，多次沖洗殘留物，殘渣處理:(1)消化結束后，在三角瓶中加入5 mL 20%的磺基水楊酸溶液.室溫放置30 min沉淀蛋白質;(2)過濾，將三角瓶殘留物用1%磺基水楊酸溶液完全沖洗到漏斗中;(3)用10 mL酒精和10 mL丙酮分別沖洗殘渣2次。小心取下濾紙及殘渣，折疊放置培養皿中，65℃烘干，移入稱量瓶并稱重。將殘渣及濾紙105℃烘干，測定干物質。殘渣及濾紙用凱氏定氮法，測定殘留物的蛋白質含量。

計算干物質和蛋白質消化率，確定0.05 mol/L HCl－KCl緩沖液中胃蛋白酶的最適用量。

1.4.2.2 胰蛋白酶最適酶量的選擇

準確稱取5份0.5 g豆粕于250 mL培養三角瓶中，用得到的最適胃蛋白酶濃度的0.05 mol/L的HCl－KCl緩沖液溶液作前處理。以放入順序取下三角瓶，用0.1 mol/L NaOH 溶液和0.1 mol/L的 HCl滴定消化液，使其 pH 6.8，量取 10 mL KH2PO4－NaOH緩沖液于三角瓶中，然后加入含不同胰蛋白酶活性條件(4、8、12、16、20 mg/mL 的 KH2PO4－ NaOH緩沖液配置)溶液各1 mL，繼續培養3 h。

按1.4.2.1的方法測定胃蛋白－胰蛋白酶兩步法得到殘渣的干物質和蛋白質的含量。

計算干物質和蛋白質消化率，確定0.05 mol/L KH2PO4－NaOH緩沖液中胰蛋白酶的最適用量。

1.4.3 胃蛋白酶 － 胰蛋白酶兩步法測定過程［17－20］

分別取5種粒度的豆粕及不同粒度豆粕配制的粉狀配合飼料、顆粒料0.5 g于250 mL的培養三角瓶中，每種樣品設3個重復，并作空白試驗。使用最適濃度的胃蛋白酶和胰蛋白酶，參照1.4.1的方法測定不同樣品的干物質和蛋白質含量，按下列公式計算干物質和蛋白質的消化率。

1.5 統計分析

試驗數據采用 SAS 9.0軟件進行分析，采用Duncan法多重比較，P ＜0.05者為差異顯著。采用Orign8.0軟件進行線性擬合并進行相關性分析作圖。

2 結果與分析

2.1 飼料原料與粒度

生產上對于粉碎的程度一般用飼料粒度表示。飼料粉碎粒度就是指飼料或原料樣品的平均顆粒大小［21］。選用 1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mm 篩孔孔徑的篩片粉碎得到的原料及粉狀配合飼料樣品的粒度如表2所示。由表2可以看出:隨著篩孔孔徑從1.0 mm擴大到3.0 mm，豆粕粉碎樣品的質量幾何平均粒徑增大(P＜0.05);粉狀配合飼料的質量幾何平均粒度隨豆粕粒度的變化未表現出明顯的變化規律:篩孔孔徑超過2.5 mm，粉狀配合飼料的粒度明顯增大。篩孔孔徑從1.0～2.0 mm，粒度變化不大(P ＞0.05)。

表2 粒度測定

王衛國等［22］對玉米和豆粕進行粉碎試驗，結果顯示粉碎篩片的篩孔孔徑與同一種原料的粉碎物的質量幾何平均粒徑隨篩孔減小而減小，且呈現一定的線性關系。本試驗再次驗證了篩孔孔徑與粒度間的線性關系(P＜0.01)，但是篩孔孔徑與粉狀配合飼料粒度之間不存在規律性，出現這種情況原因可能與飼料中豆粕添加比例小有關。

2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶最適濃度

豆粕養分消化率與胃蛋白酶濃度、胰蛋白酶濃度關系見圖1、圖2。由圖1、圖2可以得出:胃蛋白酶最適濃度是70 mg/mL，胰蛋白酶最適濃度是16 mg/mL。

2.3 粒度與豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率

2.3.1 粒度對豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率的影響

對飼料粉碎的目的是增加飼料表面積，使胃腸內的消化酶與飼料充分接觸，提高動物對飼料的消化率，提高飼料報酬。體外模擬消化方法除了受消化酶組成、劑量、pH和消化時間等影響外，還受飼料粒度的影響［23］。飼料原料粉碎粒度不同，直接影響其與消化酶的接觸面積，進而影響消化率。對于顆粒飼料，原料粒度的不同會影響飼料的調質效果，影響顆粒飼料的質量，進一步影響消化率。王衛國［17］曾對5種不同粒度12/20目，40/60目，60/80目，80/100目(12/20目表示飼料通過12目篩，留存20目篩)的玉米、麩皮、豆粕、棉粕、菜粕分別進行體外消化試驗研究，結果表明隨粉碎粒度的增加消化率均有降低的趨勢，但豆粕的變化幅度較小。第二年，其用小型錘片粉碎機在(4.5、2.5、2.0、1.0、0.6 mm)的篩片下進行粉碎，并利用胃蛋白酶－胰蛋白酶兩步體外消化法測定不同粉碎物的蛋白質體外消化率得到同樣的結果［22］。

本試驗選用濃度為70 mg/mL的胃蛋白酶，16 mg/mL的胰蛋白酶分別測出不同粒度(432、505、637、717、805 μm)的豆粕，及以不同粒度基礎加工的粉狀配合飼料及顆粒料的干物質、蛋白質體外消化率。測定結果如表3。

表3 豆粕粒度與體外消化率

從表3中可同樣得出豆粕體外DM、CP消化率隨豆粕粉碎粒度的增加均呈現降低的趨勢，但637、717、805 μm組間豆粕及顆粒料體外DM消化率差異不顯著(P ＞0.05)。豆粕粒度從 432 μm 到 505 μm和從637 μm到717 μm對豆粕體外CP消化率影響均不顯著(P ＞0.05)，這與李清曉等［24］的研究結果不一致，可能與選擇的粒度范圍和粉碎機粉碎方式不同有關;隨豆粕粒度的增加，粉狀配合飼料的體外DM、CP消化率未呈現明顯的規律性，但637 μm組DM、CP體外消化率最高;對于顆粒飼料，豆粕粒度的變化對DM體外消化率影響不明顯(P＞0.05)，但對顆粒料CP體外消化率影響明顯(P＜0.05)，隨粒度增加線性降低(P＜0.01)。比較粉狀配合飼料和顆粒料的DM、CP消化率，很容易發現顆粒料的制作對于提高飼料消化率有明顯的效果。

2.3.2 粒度與豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率的線性分析

表4 豆粕粒度(X)與體外消化率(Y)的關系

對不同粉碎粒度的豆粕及配制的粉狀配合飼料、顆粒料的體外消化率進行線性回歸分析見表4。從表4中可以看出:本試驗豆粕和顆粒料的體外消化率隨豆粕粉碎粒度的變化呈直線相關關系，即隨粒度的減小豆粕及顆粒料的消化率呈線性提高(圖2)，但對于實際生產和飼喂而言，并非粒度越細越好。適當的粉碎粒度利于原料成分混合均勻，便于顆粒飼料的制作，提高制粒的效率和顆粒質量。但粒度過小會降低粉碎生產效率，且易造成物料流動不暢，甚至形成結拱，影響正常生產。對于仔雞而言，粒度降低可通過增加與消化酶接觸的表面積，改善營養素的消化率，但也有人認為粗顆粒會降低食糜通過肌胃的速率［25］，增加與消化酶的接觸時間，從而改善能量利用率和營養素的消化率［26］，并且粒度過細蛋白質消化率提高不明顯，反而可能會加重動物胃腸的角質化和損害。對直線相關關系進行顯著性差異分析后，豆粕及顆粒料的消化率與粉碎粒度的關系為顯著性直線正相關(P＜0.01)。不同粉碎粒度的豆粕配制的粉狀配合飼料進行體外模擬消化，DM、CP消化率隨豆粕粉碎粒度的變化未出現明顯的線性規律(P=0.443、P=0.113)。這可能與豆粕在粉狀配合飼料中添加比例小有關。

圖3 粒度與消化率的關系

3 結論

隨篩孔孔徑的增大豆粕的粉碎粒度增大，并呈現一定的線性關系(P＜0.01)。豆粕粒度的變化對豆粕及顆粒料的體外消化率影響明顯，綜合考慮505 μm組和637 μm組均可得到較高的消化率，但考慮到粒度越小在粉碎過程耗費成本越大，認為637 mm為豆粕制作仔雞顆粒料最適粉碎粒度，即2.0 mm為制作仔雞顆粒料的篩片最佳篩孔孔徑。

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