悅目金蛛絲蛋白TuSp1重復模塊特征

王金雷，陳格飛，李 佳，林 瑛，孟 清

（東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620）

悅目金蛛絲蛋白TuSp1重復模塊特征

王金雷，陳格飛，李 佳，林 瑛，孟 清

（東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620）

針對蜘蛛管狀腺絲蛋白（TuSp）結構進行克隆和分析，基于悅目金蛛（Argiopeamoena，A.amoena）管狀腺總RNA，利用簡并引物和巢式聚合酶鏈反應（PCR）技術克隆Aa TuSp1編碼基因序列1 273 bp，其包含3個重復單元，每個重復單元編碼176個氨基酸，重復單元之間的序列同源性高達97%以上，且富含丙氨酸（Ala）和絲氨酸（Ser），其次是甘氨酸（Gly），組成了一系列Poly T，Poly A，PolyS，SQ和GX模體結構，推測與其獨特的力學性能相關.系統進化分析表明，不同于典型蛛絲蛋白MaSp，Flag等，Aa TuSp1及近系包卵絲蛋白形成一個獨立的進化分支.研究結果為基于TuSp1合成仿生蛛絲提供了新的結構基因藍圖.

悅目金蛛；管狀腺絲蛋白；重復單元；巢式聚合酶鏈反應（PCR）；進化

蜘蛛絲是一類具有優良力學性能和生物學特性的天然蛋白聚合纖維，在紡織、生物醫學、軍工及航空航天等領域有著廣闊的應用前景和巨大的商業價值［13］.蜘蛛在漫長的進化過程中，保留著包裹蛛卵的由包卵絲組成的卵袋結構，用于保護蛛卵免受外侵.其中，管狀腺分泌的管狀腺絲蛋白（tubuliform spidroin，TuSp）經噴絲器合成蛛絲，構成卵袋外層［46］.迄今為止，僅發現一種管狀腺絲蛋白，即TuSp1，預測分子量超過300 k Da（編碼基因長約12 kb），但結構解析尚未完成［7］.鑒于最具代表性的園蛛科蜘蛛絲蛋白結構（尤其是包卵絲蛋白）現較少報道［810］，亟待解析，國內也多局限在絲纖維力學性能研究［1112］，未見絲蛋白結構方面的報道.本文主要針對蜘蛛管狀腺絲蛋白（TuSp1）進行基因克隆和分析.首先基于悅目金蛛（A.amoena）管狀腺總RNA，利用簡并引物和巢式聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技 術 克 隆Aa TuSp1部分編碼基因序列，然后經序列比對分析其模塊特征，再經系統進化分析，證實Aa TuSp1及其近系包卵絲蛋白作為一個獨立的進化分支，分布于典型蛛絲蛋白（網捕絲，如 MaSp和Flag等）之外，是蜘蛛絲蛋白基因家族的新成員.

1 試驗材料與方法

1.1 材料與試劑

悅目金蛛采集于上海松江區周邊，Trizol?試劑、M-MLV逆轉錄酶（Invitrogen，USA），PCR克隆試劑盒（CloneJETTMPCR Cloning Kit）、長片段擴增聚合酶（Long PCR Enzyme Mix），引物合成委托上海英駿生物技術有限公司.

1.2 方法

1.2.1 蜘蛛管狀腺體分離及其總RNA提取

選取適于解剖的成熟蜘蛛個體，經CO2麻醉后活體解剖獲取管狀絲腺，解剖緩沖液參考文獻［13］配制，液氮冰凍并置于-80℃保存備用.管狀腺總RNA提取采用Trizol一步法（參照Trizol?試劑說明書），總RNA置于-80℃保存備用.

1.2.2 簡并引物設計及其PCR驗證試驗

鑒于文獻［8］報道蜘蛛包卵絲蛋白為單一外顯子編碼蛋白質，本文基于已報道序列保守區設計簡并引物，并利用基因組DNA進行PCR驗證試驗.根據現有報道的3條蜘蛛管狀腺絲蛋白序列：銀金蛛 （A.argentata）TuSp1 （基 因 登 錄 號：AAY28932）、橫紋金蛛（A.bruennichi）ECP1（基因登錄號：BAE86855）、蔽日蛛（A.aurantia）TuSp（基因登錄號：AAX45292），經Blockmaker（http：／／blocks.fhcrc.org／blocks／make＿blocks.html）比對，得到高度保守的連續氨基酸區域；登陸Code Hop數據庫（http：／／blocks.fhcrc.org／codehop.html）進行簡并引物搜索，參數設置為 Maximum core degeneracy：64；Target clamp temperature：60 ℃；Genetic code：standard；Codon usage table：Bombyx mori，Codon usage table一項選用與蜘蛛相似的家蠶作為參考，并結合對上述3條序列重復單元的分析，篩選出1對簡并引物，如表1所示.

通過改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法分離悅目金蛛高質量基因組DNA（genomic DNA，gDNA）［14］.以gDNA稀釋產物為模板，結合簡并引物進行簡并PCR擴增，克隆測序目的產物得到一條282 bp DNA序列.經Blast N在線同源比對分析，確定該序列為悅目金蛛包卵絲蛋白TuSp1部分編碼序列.根據該DNA序列設計巢式PCR引物，如表1所示，以備后用.

表1 簡并引物列表Table 1 Degenerate primers

1.2.3 管狀腺絲蛋白TuSp1基因克隆與測序分析

以管狀腺腺體總RNA為模板，Outer Primer為反 轉 錄 引 物，利 用 M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）逆轉錄酶進行反轉錄.反轉錄體系為20μL，反應條件為70℃，10 min；冰上急冷；42℃，1 h；70℃，10 min；以引物S1和Outer Primer為上下游引物進行第1輪擴增，反應體系為Long PCR Enzyme Mix操作體系（50μL），反應條件為94℃，預變性2 min；然后90℃，40 s；50℃，30 s；68℃，1.5 min，10個循環，再經過90℃，40 s；55℃，30 s，68℃，1.5 min，25個循環，其中68℃處理時每一循環增加5 s，最后68℃，10 min.以第1輪擴增產物為模板，以引物S1和Inner Primer為上下游引物進行第2輪擴增，反應體系同第一輪，反應條件為94℃，預變性2 min；然后90℃，40 s；55℃，30 s；68℃，1.5 min，30個循環，最后68℃，10 min.擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收，克隆入pJET1.2／blunt cloning vector（CloneJETTMPCR Cloning Kit）送北京華大基因研究中心測序分析.

1.2.4Aa TuSp1序列比對與進化分析

首先，基于Blast X平臺檢索NCBI蛋白質數據庫，隨后利用BLASTCLUST鑒定試驗獲得A.amoenaTuSp1編碼基因序列為非冗余序列.然后，利用 EMBOSS程序（equicktandem／etandem）檢索重復單元［15］.由DNAMAN V 5.2.2軟件完成氨基酸序列預測和氨基酸組成分析工作.

對本文發現的A.amoenaTuSp1序列及文獻［16］報道的蛛絲蛋白cDNA序列進行同源比對分析，采用 MEGA V5.0軟件［17］進行系統進化分析.

2 研究結果與討論

2.1 AaTuSp1重復模塊序列克隆與序列分析

本文利用巢式PCR擴增獲取一條悅目金蛛管狀腺絲蛋白編碼基因序列1 273 bp（基因登錄號：JQ291306），驗證試驗發現包含1.2.2節中得到的282 bp DNA序列.在線比對分析確定其為TuSp1部分cDNA序列，命名為Aa TuSp1.預測氨基酸序列如圖1所示.其中，粗體和白體表示不同重復單元；下劃線表示GX（X代表N，F，T，L，I等氨基酸）和Poly T重復模塊.編碼氨基酸序列長度由424個氨基酸殘基組成，包含3個重復單元，每個重復單元528 bp（編碼176個氨基酸），重復單元之間的序列同源性高達97%以上.

以Aa TuSp1重復單元為參照，利用Blast P進行GenBank非冗余蛋白庫同源搜索比對.借助同源分析結果，對與A.amoena近源的3種蜘蛛（A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus）的TuSp1進行重復單元的劃分，A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus的重復單元分別由180，180和184個氨基酸組成，均大于A.amoena包卵絲蛋白Aa TuSp1的重復單元（176個）.現有研究表明，蛛絲蛋白主要由4種典型的重復模塊組成：An，（GA）n，（GGX）n和 GPGXn，因此甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）含量較高［1819］.利用DNAMAN軟件對A.amoena，A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus重復單元進行氨基酸組成分析，結果如圖2所示.由圖2可以看出，4種蜘蛛的重復單元均富含Ala和絲氨酸（Ser），且Gly，Ser和Ala含量均高于25%，其氨基酸組成均不同于典型的蛛絲蛋白，并組成了一系列Poly T，Poly A，PolyS，SQ和GX模體結構，推測與其獨特的力學性能和生物學特性相關.和SOPMA算法）對該重復單元進行二級結構預測，均證實大多數氨基酸折疊成Helix結構，僅有很少的氨基酸形成Strand結構.由于βsheet結構與蛛絲纖維的強度相關，Helix與延展性對應，因此這種富含Helix結構、缺少Strand結構可以用于解釋包卵絲蛋白的低強度和高延伸性，但包卵絲蛋白TuSp1的氨基酸組成和折疊結構與包卵絲纖維的力學性能和生物學特性還有待更深層的研究［25］.

圖1 AaTuSp1預測氨基酸序列分析Fig.1 Analysis of predicted amino acid sequence of AaTuSp1

系統進化分析發現，TuSp1與拖絲蛋白（MaSp）和鞭毛狀絲蛋白（Flag）分別位于不同的節點之內，如圖4所示，這表明包卵絲蛋白是一個新的絲蛋白亞家族.本文發現的Aa TuSp1將為合成仿生蛛絲提供了新的結構基因藍圖.

3 結 語

（1）由于重復單元及其內部重復模體的頻繁出現，常規PCR方法獲取蜘蛛管狀腺絲基因無法獲得理想效果，因此成為仿生蛛絲的瓶頸.本文采用簡并引物與巢式PCR相結合的方法為蛛絲蛋白基因的獲取提供了新思路.

（2）本文發現的Aa TuSp1具有穩定的均勻序列重復特性，重復單元之間同源性高達97%以上，這種結構模式與傳統的蛛絲蛋白（如拖絲和鞭毛狀絲等）不同.

（3）系統進化分析表明，包卵絲蛋白是一個新的絲蛋白亞家族，這為后續的人工仿生蛛絲提供了基因藍圖.

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Characterization of Spidroin TuSp1 Repeat Module fromArgiopeAmoena

WANGJin-lei，CHENGe-fei，LIJia，LINYing，MENGQing

（Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China）

Cloning and structural analysis of tubuliform spidroin（TuSp）were performed based on the extraction of total RNA ofArgiopeamoenatubuliform，degenerate primers and the technique of nested polymerase chain reaction（PCR）were used to obtainAa TuSp1，which was 1 273 basepairs，and included three repeats.Each repeat contained 176 amino acids，and among these repeats，the identity was up to 97%.The sequence was rich in Ala，Ser and Gly，and formed a series of motifs，such as Poly T，Poly A，PolyS，SQ and GX，which may be related with the mechanical characterization.Phylogenetic analysis demonstrated that AaTuSp1 formed a new branch that was different from MaSp，Flag and so on.The research results provided a new gene blueprint for biomimicing spider silk.

Argiopeamoena；tubuliform spidroin；repeat unit；nested polymerase chain reaction（PCR）；evolution

Q 78

A

2012 02 06

國家“八六三”高技術研究發展計劃資助項目（2006AA03Z451）；國家自然科學基金資助項目（31070698）；上海市基礎研究重點資助項目（10JC1400300）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20120075110007）

王金雷（1986—），男，上海人，碩士研究生，研究方向為蛛絲蛋白基因的克隆及表達.E-mail：leow＠mail.dhu.edu.cn

孟 清（聯系人），男，教授，E-mail：mengqing＠dhu.edu.cn

1671-0444（2013）02-0196-06