VEGF、HIF-1在急性肺栓塞模型大鼠肺組織中的表達及相關性

陳 婷 朱曉良 杜紫燕

(蘇州大學附屬第二醫院呼吸內科，江蘇 蘇州 215004)

肺血栓栓塞(PTE)發生機制主要為血栓性或者其他性質栓子(包括羊水、氣體、脂肪)隨體循環方向流動而造成肺動脈栓塞〔1，2〕。PTE的栓子主要來自下肢深靜脈血栓，血栓或栓子直接堵塞造成肺動脈發生痙攣，肺血管床供血能力下降、供應面積減少，肺血管阻力逐漸增加并且肺動脈壓逐漸增高〔3，4〕，危重者導致右心功能不全，甚至休克、死亡。血管內皮生長因子(VEGF)是促進并且誘導特異性血管內皮細胞生長的細胞因子，在血管生成過程中起到了重要的作用〔5〕。缺氧誘導因子-1(HIF-1)主要作用有促進血管生成，同時對體內氧氣運輸及通氣進行調節，同時對各種酶的酵解作用進行調控以利于提高機體對缺氧的耐受能力〔6〕。本文制備大鼠急性肺栓塞(APE)模型并研究VEGF、HIF-1表達水平。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重為200～220 g，大鼠均由大連醫科大學動物實驗中心提供，包括兔抗大鼠多克隆抗體、兔抗大鼠單克隆抗體VEGF一抗、HIF-1一抗及鏈霉素合素以生物素復合物(SABC)試劑盒等均由美國Sigma公司提供。二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德。

1.2 實驗方法 建立APE大鼠模型，采用改良右心導管術建立自體血栓APE大鼠模型〔7〕:腹腔注射20%烏拉坦6 ml/kg麻醉，必要時追加0.5 ml/h，無菌條件下沿頸前正中線做長約2 cm切口，鈍性分離右頸外靜脈，插管接YP100型壓力傳感器，量程為(－10～10 KPa)，動態監測肺動脈壓變化。從頸動脈采血1 ml，迅速注入聚乙烯導管內。室溫下放置30 min左右，在凝固后加入生理鹽水，制備直徑0.8～0.9 mm、長10 mm的自體血栓。取50只Wistar大鼠，正常組10只，其余40只按取肺組織時間不同，分為 1、6、12、24 h四組，每組 10只。大鼠采用10 g/L戊巴比妥1.2 ml進行麻醉，從頸總靜脈插管將栓子注入，注栓速度為0.5 ml/s，保持肺動脈收縮壓持續為50 mmHg，每只注入3個栓子，正常對照組注入等量的生理鹽水。采用正常組為對照，在1、6、12及24 h分別進行開胸留取肺組織。

1.3 免疫組化學法 用4%水合氯醛以10 ml/kg腹腔注射麻醉后開胸，將針頭插入左心室，剪開右心耳，先用200 ml生理鹽水灌流將血沖凈，然后用250 ml的4%多聚甲醛灌流固定，取組織，石蠟包埋。切片常規脫蠟至水，30%H2O2阻斷，枸櫞酸鹽緩沖液加熱抗原修復，5%胎牛血清(BSA)封閉，37℃下放置30 min，滴加稀釋的一抗(按1∶200稀釋)，4℃過夜。次日依操作順序加入二抗及SABC，室溫DAB顯色，封片后應用顯微鏡觀察。

1.4 結果判定 HIF-1α陽性結果顯示為鏡下出現細胞核或者胞漿內有棕黃色顆粒，并根據染色強度進行打分:無色(0分)，淺黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分);再依據陽性細胞所占百分比進行打分:陽性細胞＜5(0分)，5～25(1分)，25～50(2分)，50～75(3分)，＞75(4分);染色強度同陽性細胞百分比乘積進行評分:9～12分(強陽性?)，5～8分是弱陽性(+)，0～4分是陰性(－)，VEGF陽性細胞判定主要依據Takahashi等實驗方法依據細胞漿或者胞膜鏡下棕黃色者為陽性，將VEGF表達共可分為(－)～(?)4級。采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統測定實驗切片的光密度值，取平均值。

1.5 統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行分析，均值比較應用單因素方差分析，而HIF-1和VEGF之間的相關性應用直線相關分析。

2 結果

2.1 模型制備結果 制備APE大鼠模型過程中，僅有2只死亡，其制備成功率為95%(38/40)，注入栓子5 min左右，大鼠的肺動脈壓明顯升高，并出現呼吸加深加快，30次/min，口唇紫紺，活動明顯減少，多為俯臥位，雙肺彌漫性干濕啰音等肺栓塞體征。經頸靜脈注栓后1 h，自頸外靜脈給予放射性核素99 mTC-MAA，術后經ECT肺灌注掃描顯示雙肺呈明顯放射性充盈及缺損。隨時間的延長，大鼠逐漸適應缺氧現象，24 h后活動量逐漸增加。蘇木素一伊紅(HE)染色可見肺動脈及小血管內存在大小不等的栓子，周圍有大量炎性細胞聚集，伴血管內膜不同程度水腫及局部肺組織實質變。

2.2 HIF-1α和VEGF的表達 正常組大鼠肺組織內顯示無HIF-1α表達，而實驗組大鼠的肺組織在細胞胞核及胞漿內于各個時間點均顯示 HIF-1α表達(陽性率100%)，強度為(?)～(?)，VEGF、HIF-1蛋白表達水平均升高，與對照組相比較，其差異有統計學意義(t1=4.274，t2=5.137，均 P＜0.05)，表達強度與時間呈正相關，在模型制作12 h時升高最為顯著。通過觀察栓塞后大鼠肺組織中HIF-1α和VEGF在各個時間點的表達，發現其兩者表達強度呈正相關(r=0.800，P＜0.05)。見表1，表2。

表1 HIF-1α在大鼠肺組織內的表達(n=10)

表2 VEGF在大鼠肺組織內的表達(n=10)

3 討論

本研究結果表明PTE疾病介導的缺氧肺組織中主要存在HIF-1α，其主要通過對VEGF表達調節來降低肺細胞的耗氧量，從而在缺氧狀態下增強肺細胞的耐受能力，增強肺細胞耐缺氧能力。

VEGF主要作用包括促進血管內皮生長及側支循環的建立，在血管生成中起到關鍵作用，作為具有高度特異性受體的血管內皮細胞因子，主要和特異性受體flk-1相結合，發揮介導血管內皮細胞增殖及分化作用;利于血管通透性增加并同時參與新生血管形成。缺氧是刺激VEGF生成的最關鍵因素。經研究證實〔8，9〕，在低氧環境中 VEGF mRNA及 VEGF蛋白表達較高，顯示新生血管的生成及其側支循環的建立是通過對VEGF基因表達的調控達到最終目的。位于血管內皮細胞的VEGF受體可經VEGF因子激活，從而激活下游系列缺血相關通路起誘導新生血管生成及側支循環建立〔10〕。

綜上所述，在APE模型中VEGF、HIF-1均可作為治療靶點，且HIF-1表達可能起到啟動作用，臨床治療可以參照相關理論依據進行靶點治療，保護肺組織。

1 呂 倩，王昌明，蔣 明，等.HIF-1α和VEGF在大鼠COPD中的表達及與肺血管重構的關系研究〔J〕.中國藥理學通報，2012;28(6):772-7.

2 丁曉倩，關 鍵.HIF-1α、VEGF在慢支及COPD大鼠肺組織的表達及意義〔J〕.現代生物醫學進展，2010;10(3):478-80.

3 李 兵，高德偉，劉朝陽，等.大鼠急性肺血栓栓塞后VEGF、HIF-1的表達變化及相關性〔J〕.軍醫進修學院學報，2010;31(7):726-7，36.

4 金小紅，王昕昕，金海華，等.哮喘模型大鼠肺組織血管內皮生長因子的表達及布地奈德干預的影響〔J〕.海峽藥學，2010;22(9):21-4.

5 Xu B，Gao X，Xu J，et al.Ischemic postconditioning attenuateslungreperfusion injury and reduces systemic proinflammatory cytokine release via heme oxygenase 1〔J〕.J Surg Res，2011;166(2):157-64.

6 喬 莉，張勁松，陳 彥，等.鹽酸戊乙奎醚預處理對大鼠肺損傷早期血管內皮生長因子的影響〔J〕.實用老年醫學，2009;23(1):65-9.

7 王怡軍，孫云輝，張一梅，等.急性肺栓塞大鼠肺血管內膜VEGF及其受體2的變化〔J〕.中國誤診學雜志，2008;8(31):7576-7.

8 楊 堅，張維錄.老年肺栓塞實驗診斷研究現狀〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1):176-8.

9 Draenert A，Marquardt K，Inci I，et al.Ischaemia-reperfusion injury in orthotopic mouse lung transplants-a scanning electron microscopy study〔J〕.Int JExp Pathol，2011;92(1):18-25.

10 馬 宇，王一彪，朱曉波，等.高肺血流性肺動脈高壓大鼠血清、肺動脈壁組織中VEGF和CTGF的表達變化及意義〔J〕.山東醫藥，2010;50(22):29-30.