炎性反應與細胞凋亡在腦梗死后的動態變化及其機制

王學慧 毛旭強

(南京醫科大學附屬無錫市人民醫院，江蘇 無錫 214008)

缺血性腦梗死是一種致殘和致死率較高的腦血管疾病，好發于老年人。在缺血性腦損傷中，多種凋亡誘導信號是造成神經細胞凋亡的重要原因。其中炎性因子白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和細胞凋亡因子Bcl-2與其最為密切相關〔1〕。有研究表明，局灶性腦缺血時，過度的炎性反應會對機體及患者的預后產生不良影響。但目前，炎性因子和細胞凋亡因子的動態變化對腦梗死后神經細胞凋亡的關系尚未闡明〔2〕。本研究旨在探討炎性因子IL-1β、TNF-α和Bcl-2在腦梗死后的動態變化，揭示腦缺血/再灌注時神經細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD雄性大鼠，8～9周齡，體重280～320 g，由廣東醫學院實驗動物中心提供;IL-1β雙抗體一步夾心法ELISA檢測試劑盒由上海逸峰生物科技有限公司提供;TNF-α雙抗體一步夾心法ELISA檢測試劑盒由上海研吉生物科技有限公司提供;TUNEL試劑盒由Roche公司提供;兔抗Bcl-2抗體由福州邁新生物技術開發有限公司提供。

1.2 腦梗死大鼠模型制備 將60只SD雄性大鼠隨機分為假手術組及再灌注6、12、24、48和96 h組，大鼠模型制備前禁食不禁水12 h，并在室溫環境下，腹腔注射1.0%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉。參照Longa等〔3〕的方法，采用插線法致大鼠大腦中動脈栓塞2 h。模型組大鼠仰臥固定在手術臺，消毒后行頸正中切口，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在CCA和ECA近心端處永久結扎，臨時夾閉ICA，在CCA近分叉處剪一斜行切口，并緩慢插入尼龍線，至1.8～2.1 cm處遇到阻擋感時即停止插線，從而造成大腦中動脈局灶性缺血，梗死2 h后，拔出線栓。假手術組除不插入尼龍線外，其余操作與模型組一樣。并分別在再灌注6、12、24、48和96 h對部分大鼠取腹主動脈血，另一部分大鼠斷頭取腦，石蠟包埋。

1.3 檢測方法

1.3.1 IL-1β和TNF-α的檢測 各組大鼠在手術結束時，剝離右側大腦皮質制備勻漿液，取上清液進行蛋白定量。分別按照IL-1β、TNF-α雙抗體一步夾心法ELISA檢測試劑盒使用說明書進行操作。

1.3.2 組織病理學觀察與TUNEL法檢測細胞凋亡 部分石蠟常規脫蠟至水，然后行HE染色，脫水，封片，在光學顯微鏡下即可觀察腦細胞形態學變化并拍照。另取部分石蠟切片經脫蠟、水合后，按TUNEL試劑盒使用說明書進行操作，以染成深棕色的為凋亡細胞，在光學顯微鏡下即可觀察。選取20倍物鏡拍照，采用陽性染色像素計數計算凋亡細胞總數。

1.3.3 免疫組織化學法 部分石蠟切片脫蠟至水，放入3%H2O2室溫孵育 5 min，再移入 10 mmol/L PBS浸泡 2次(5 min/次)后，置入5%山羊血清，室溫孵育10 min。滴加一抗工作液，4℃孵育過夜。10 mmol/L PBS沖洗3次(5 min/次)后，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min。10 mmol/L PBS沖洗3次(5 min/次)后，滴加辣根酶復合物工作液，37℃孵育30 min。10 mmol/L PBS沖洗3次(5 min/次)后，滴加DAB顯色劑顯色5～15 min(由染色程度決定顯色時間)。自來水充分沖洗、脫水、透明、封片。

1.4 統計學方法 應用SPSS16.0軟件，計量資料采用表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 炎性反應在腦梗死后的動態變化 IL-1β水平在再灌注6 h顯著升高，在12 h達到最高，24 h則開始下降，但仍顯著高于假手術組的水平(P＜0.05或P＜0.01);與假手術組比較，TNF-α在再灌注6、12 h無明顯變化，在24 h顯著升高(P＜0.05)，48 h達到最高(P＜0.01)。見表1。

2.2 細胞凋亡在腦梗死后的動態變化 神經細胞數量在再灌注6 h顯著降低(P＜0.05)，至48 h降到峰值(P＜0.01)，96 h后已基本恢復;細胞凋亡數量在再灌注6 h開始升高，到24 h達到最高，48 h開始下降，至96 h仍顯著高于假手術組的數量(P＜0.01);Bcl-2表達在再灌注6 h開始降低，以后各時相持續下降 ，顯著低于假手術組(P＜0.01)。見表2。

表1 IL-1β、TNF-α水平在腦梗死后的動態變化(，n=10)

表1 IL-1β、TNF-α水平在腦梗死后的動態變化(，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

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表2 神經細胞數量、細胞凋亡及bcl-2表達在腦梗死后的動態變化，個/mm2)

表2 神經細胞數量、細胞凋亡及bcl-2表達在腦梗死后的動態變化，個/mm2)

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3 討論

在缺血性腦梗死患者中，神經細胞死亡的方式有壞死和凋亡。而在發生缺血性腦梗死的整個病程中，神經細胞的死亡方式同時存在壞死和凋亡〔4〕。為進一步闡明腦缺血/再灌注時神經細胞損傷的機制，指導臨床研發抗缺血再灌注性腦損傷藥物，從而在有效防治腦梗死方面帶來一定的醫用價值，因此，本文通過建立局灶性腦缺血大鼠模型，并在再灌注6、12、24、48和96 h 5個時相點觀察炎性反應與細胞凋亡的動態變化及探討其內在機制。

本研究結果說明在局灶性缺血6 h后，神經細胞死亡的方式主要是壞死;而在以后時間點，神經細胞數量減少與細胞凋亡增加互相吻合，提示在急性缺血性腦梗死后期，經細胞死亡的方式主要是凋亡〔5〕。

IL-1β是一種促炎性細胞因子，能通過間接增加白細胞，增強炎性反應，從而加重缺血性腦損傷，最終誘導神經細胞凋亡〔6〕。本研究結果說明過度的炎性反應會增加細胞凋亡數量。TNF-α亦是一種促炎性細胞因子，可廣泛參與炎性反應。局灶性腦缺血后，神經元及小膠質細胞等均可使TNF-α水平升高，從而加重腦組織損傷〔7〕。本研究結果說明神經細胞凋亡數量的增加可能與過高的TNF-α水平有關。Bcl-2是一種抗凋亡因子，對缺血腦組織細胞具有保護作用，能夠對細胞凋亡起到抑制作用〔8，9〕。神經細胞凋亡與Bcl-2水平表達過低有關，抗凋亡因子bcl-2對細胞凋亡的抑制作用可能僅是一種生理保護作用〔10〕。

綜上所述，缺血性腦梗死后神經細胞凋亡的動態變化可能與炎性因子IL-1β、TNF-α水平的升降及Bcl-2的表達有關。

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