綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因克隆與系統發育分析

劉紅彬 顧小龍

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

Wels等〔1〕構建的免疫毒素可使裸鼠體內的移植瘤消退。由美國國立癌癥研究所研制的新型免疫毒素BL22，在白血病臨床試驗中更顯示了“生物魔彈”的神奇威力〔2〕。綠膿桿菌外毒素(PE)是有效的細胞殺傷劑，只要一個毒素分子進入細胞質就足以殺死細胞。PE是613肽的單鏈毒素蛋白，通過細胞識別區和跨膜區將具有ADP-核糖基化活性的毒性區導入細胞，催化細胞內的延伸因子(EF-2)發生ADP-核糖基化反應，使EF-2滅活而殺死細胞。據Hwang等〔3〕報道，缺失Ⅰa區的PE分子(即PE40)對培養細胞的毒性很低，但卻具有完全的毒性活性，將PE40與抗體或生長因子等導向分子連接，能選擇性殺傷特定靶細胞。因此，PE40作為毒素彈頭基因廣泛用于免疫毒素的研究〔4～6〕。利用PCR技術從綠膿桿菌ATCC9027基因組DNA中擴增PE40基因，與pMD18-T simple載體連接后測序，獲得用于構建分子免疫毒素的毒素彈頭基因PE40。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒 綠膿桿菌ATCC9027，購自廣東省微生物菌種保藏中心。感受態大腸桿菌JM109和pMD18-T simple vector購自寶生物大連公司。

1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、內切酶HindⅢ和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司。

1.3 引物 根據綠膿桿菌標準毒株PA103外毒素基因序列〔7〕，自行設計引物，上下游引物引入HindⅢ酶切位點，目的是為了將PE40亞克隆至表達載體，致上下游引物分別長33 bp和 31 bp。上游引物:5'-AAGCTTATGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACC-3';下游引物:5'-AAGCTTCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3';引物由上海生物工程有限公司合成

1.4 綠膿桿菌ATCC9027基因組DNA的制備 酚/氯仿法。

1.5 PCR反應體系 2.5μl 10×PCR擴增緩沖液，2μl dNTP混合物(10 mmol/L)，上下游引物各 0.5μl，1μlDNA模板(20 ng)，Taq DNA聚合酶0.5 μl，50%甘油5 μl，滅菌水13 μl，總體積25μl。反應條件:94℃預變性5 min，接著進入循環，94℃變性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，共循環 30個周期，72℃終末延伸10 min。取5μl PCR產物，在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，美國伯樂凝膠成像系統拍照。

1.6 克隆PE40 純化PCR產物與PMD18-T simple載體16℃連接3 h，連接產物轉化E.coli JM109感受態細胞，轉化菌液均勻涂布于含Amp、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培養過夜，藍白斑篩選陽性克隆，將此克隆質粒命名為pT-PE40。克隆質粒經HindⅢ酶切鑒定后測序。

1.7 序列比對 將獲得的PE40基因序列在Genbank中進行blast搜索，下載一致性高的PE基因序列，以PE40基因序列為內群，以白喉毒素基因為外群進行系統發育分析。用ClustalX(2.0)軟件進行多序列比對，多序列比對參數為:空位開放罰分15;空位延伸罰分6.66;DNA轉換權重0.5;延遲趨異序列30%。比對結果用MegA 4.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)繪制系統發育樹。

2 結果

2.1 甘油對PCR的影響 綠膿桿菌外毒素基因PE40基因片段G+C含量高達72.56%，PE40基因片段的擴增必須依賴于一定濃度的甘油。不加甘油時，PE40基因片段不能被成功擴增;而甘油濃度超過20%時，PE40基因片段也不能被成功擴增。甘油濃度為10%時，經擴增得到的PE40基因片段量最多。見圖1。

圖1 甘油對PCR的影響

2.2 克隆綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因 純化PCR產物與PMD18-T simple載體連接，電泳結果顯示陽性克隆質粒為3 790 bp。見圖2。

2.3 酶切鑒定 酶切產物電泳結果顯示2條帶，T載體片段長2 322 bp，PE40片段長1 088 bp。見圖3。

2.4 綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因序列堿基突變分析 綠膿桿菌國際標準毒株被命名為PA103，ATCC9027與PA103的PE40進行核苷酸比對，一致性為98.8%，ATCC9027產生了14個堿基的突變，由此導致8個氨基酸的突變，對應PA103外毒素蛋白一級序列為:甘胺酸354(GGC)→絲氨酸341(AGC)，丙氨酸362(GCG)→谷氨酸346(GAG)，天冬酰胺364(AAC)→絲氨酸364(AGC)，纈氨酸Val419(GTG)→谷氨酸419(GAG)，絲氨酸506(TCG)→色氨酸506(TGG)，蘇氨酸514(ACC)→丙氨酸514(GCC)，絲氨酸515(AGC)→甘氨酸515(GGC)，亮氨酸Leu556(CTC)→脯氨酸556(CCC)。

2.5 綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因系統發育分析下載的 PE基因序列有 AE004091，AY585869，CP000438，EU595734， EU595736， FM209186， K01397， U78761 和AY820132。另在以前的研究中獲得綠膿桿菌 ATCC27853的PE40基因序列。將這10條序列及ATCC9027的PE40基因序列作為內群，以白喉毒素為外群進行系統發育分析，繪制系統發育樹。系統發育樹顯示綠膿桿菌外毒素PE40基因系形成單系群。綠膿桿菌ATCC9027與ATCC27853的PE40基因處于一個分支，說明二者的親緣關系近。

圖2 p T-PE40電泳結果

圖3 p T-PE40的HindⅢ酶切結果

3 討論

綠膿桿菌能分泌多種與毒力有關的細胞外物質，其中以外毒素A最為重要。外毒素A機制與白喉毒素有些類似，即修飾肽鏈延伸因子-2(EF-2)，使之發生ADP-核糖基化，致蛋白質生物合成停止從而殺死細胞〔8〕。Arg276和Arg279是毒素跨膜轉運的關鍵性位點。ADP-核糖基化的關鍵位點有谷氨酸553、組氨酸426、組氨酸440、色氨酸466、精氨酸458、精氨酸467、酪氨酸481、精氨酸486-492，綠膿桿菌ATCC9027外毒素PE40基因的測序結果表明，以上關鍵位點的氨基酸均未發生突變，產生變化的8個氨基酸均不是文獻報道中的重要活性位點，這些突變不會對 PEA的酶活性及細胞毒性產生影響，因此，來自ATCC9027的PE40基因可用于構建免疫毒素。

PE構建的免疫毒素，已在惡性腫瘤和艾滋病的導向治療〔4～6，9〕中取得了巨大的成功，其中重組免疫毒素制劑 ONTAK已被美國FDA批準上市，另美國國立癌癥研究所研制的新型免疫毒素BL22，在白血病臨床試驗中顯示了“生物魔彈”的神奇威力。還可利用PE開發綠膿桿菌疫苗，其是一種很好的疫苗蛋白，不論制成無毒的PE片段或與其他抗原融合，都可以運用到疫苗發展上。針對肝癌細胞的治療方面，利用PEA能夠攜帶蛋白質或DNA進入細胞中的特殊功能，可以開發出極佳的基因治療工具或蛋白質治療藥物。隨著分子生物學的發展，將會有更多、效果更好的免疫毒素用于腫瘤的治療。

1 Wels W，Harwerth LM，Muller M，et al.Selective inhibition of tumor cell growth by a recombinant single-chain antibodytoxin specific for the erbB-2 receptor〔J〕.Cancer Res，1992;52(22):6310-7.

2 Kreitman RJ，Wilson WH，Bergeron K，et al.Efficacy of the anti-CD22 recombinant immunotoxin BL22 in chemotherapy resistant hairy-cell leukemia〔J〕.N Engl J Med，2002;345(4):241-7.

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5 賈 怡，李 虹，陳文捷，等.新型重組免疫毒素DT390-mRantes治療小鼠EAE的初步研究〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2007;23(3):236-9.

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8 Iglewski BH，Kabat D.NAD-dependent inhibition of protein synthesis by Pseudomonas aeruginosa toxin〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1975;72(6):2284-8.

9 Foss FM，Bacha P，Osann KE，et al.Biological correlates of acute hypersensitivity events with DAB(389)IL-2(denileukin diftitox，ONTAK)in cutaneous T-cell lymphoma:decreased frequency and severity with steroid premedication〔J〕.Clin Lymphoma，2001;1(4):298-302.