吉西他濱聯合培美曲塞不同序貫用藥時序對HUT-78細胞增殖及凋亡的影響

韓正祥 趙琳玉 杜秀平

(徐州醫學院附屬醫院腫瘤科，江蘇 徐州 221002)

皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)屬于外周 T細胞淋巴瘤(PTCL)中的一種，其發病率低，但惡性程度高，可累及淋巴結和內臟，預后較差。吉西他濱為核苷類藥物，雖然2011年的美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南確立了吉西他濱在淋巴瘤等腫瘤治療中的地位，但對提高PTCL的療效仍有限。一項研究顯示，吉西他濱治療進展期CTCL患者，即使完全緩解率(CR)達到了22%，但中位緩解期只有10個月〔1〕。培美曲塞為多靶點葉酸拮抗劑，臨床研究顯示，培美曲塞對白血病細胞有細胞毒作用〔2〕，但對PTCL的研究較罕見。本研究旨在探討吉西他濱與培美曲塞單藥及不同聯合用藥時序方案對T淋巴細胞白血病細胞株HUT-78細胞增殖及凋亡的影響，為擴大CTCL臨床治療手段奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HUT-78，吉西他濱，培美曲塞，RPMI1640培養液，胎牛血清，膽囊收縮素八肽(CCK-8)試劑盒，膜聯蛋白V-綠色熒光蛋白(AnnexinV-FITC)凋亡試劑盒。

1.2 細胞培養 將HUT-78常規培養在含有10%胎牛血清的1640培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱內培養。

1.3 繪制生長曲線 連續7 d計數并繪制HUT-78細胞生長曲線。取對數生長期HUT-78細胞，離心，用完全培養基稀釋成2×105/ml的細胞懸液，按每孔1 ml接種于24孔板，分7組，每組3孔，1～7 d計數并繪制生長曲線。

1.4 分組 共分7組:單藥吉西他濱組(G組)、單藥培美曲塞組(P組)、吉西他濱、培美曲塞同時給藥組(G+P組)、先用吉西他濱24 h后用培美曲塞組(GP組)、先用培美曲塞24 h后用吉西他濱組(PG組)、陰性對照組(D組)及空白對照組。

1.5 CCK-8檢測增殖 取對數生長期的HUT-78細胞，離心，以RPMI1640培養基調整細胞懸液濃度為1.6×105/ml，100μl/孔，接種于96孔板，每組6個平行復孔。按實驗設計進行實驗，終止培養時，每孔加入10μl的CCK-8，繼續培養3 h，酶標儀測定450 nm波長處每孔的光密度(OD)值。吉西他濱終濃度分別為:0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 μg/ml;培美曲塞終濃度 分 別 為:0.137、0.412、1.235、3.703、11.111、33.333、100 μg/ml，分別作用細胞24、48、72 h后測定其抑制率，根據濃度反應曲線計算兩藥的IC50值。按照實驗分組，應用兩藥的IC50濃度作用HUT-78細胞，作用72 h后測定其抑制率。

1.6 AnnexinV-FITC法檢測凋亡 每孔接種4.8×105個細胞，按照實驗分組，每組作用時間均為72 h，收集細胞，按照AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒說明書要求處理待測細胞，立即在流式細胞儀上檢測，實驗重復3次。

1.7 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行分析，實驗結果以表示，組間比較采用One-way ANOVA。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HUT-78細胞1～7 d的生長情況 于接種第2天進入對數生長期，第6天進入平臺期。見圖1。

2.2 吉西他濱單藥抑制HUT-78細胞增殖的結果 吉西他濱在終濃度為0.002 ～0.01 μg/ml范圍內，作用細胞24、48、72 h，抑制率具有濃度依賴性及時間依賴性，即隨著藥物濃度的增加及藥物處理時間的延長，其抑制率逐漸增加。在24、48、72 h的時間點，其相鄰濃度的抑制率之間差異有統計學意義(P＜0.05)。在不同的濃度下，其相鄰時間點的差異同樣具有統計學意義(P＜0.05)。48 h吉西他濱的IC50值為(7.50±0.71)×10－3μg/ml。見圖 2。

圖1 HUT 78細胞的生長曲線

圖2 吉西他濱對HUT 78細胞增殖的影響

2.3 培美曲塞單藥抑制HUT-78細胞增殖的結果 培美曲塞在終濃度為0.137～100 μg/ml范圍內，作用細胞24、48、72 h，抑制率具有濃度依賴性及時間依賴性，隨著藥物濃度的增加及藥物處理時間的延長，其抑制率逐漸增加。在不同的時間點，100μg/ml及33.333μg/ml差異無統計學意義(P＞0.05)，其余濃度組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。在不同的濃度下，相鄰時間點的差異具有統計學意義(P＜0.05)。48 h培美曲塞的IC50值為(1.72±0.52)μg/ml。見圖3。

圖3 培美曲塞對HUT 78細胞增殖的影響

2.4 吉西他濱及培美曲塞不同處理組72 h對HUT-78細胞增殖的影響 以吉西他濱及培美曲塞IC50濃度作用于HUT-78細胞，單藥 G組抑制率為(55.85±2.72)%，P組為(76.37±2.83)%，聯合組中GHP組抑制率為(81.66±2.26)%，PG組為(86.53±2.43)%，均較單藥組高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，而PG組抑制率較G+P組高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。GP組為(61.56±2.75)%，比單藥P組抑制率低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.5 AV-PI雙染法檢測吉西他濱及培美曲塞不同處理組于72 h對HUT-78細胞凋亡的影響 對于HUT-78細胞，對照組凋亡率為(6.66±0.60)%，與各藥物組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。其中PG組凋亡率最高，為(31.69±1.16)%，其次為G+P組，凋亡率為(29.41±0.89)%，P組為(25.63±0.77)%，GP組為(13.90±0.49)%，G組為(12.02±0.91)%。各處理組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

CTCL是結外T細胞性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一類亞型，占NHL的1% ～2%。因其具有明顯異質性，標準化治療方案難以統一，早期以局部治療為主，進展期則以全身治療為主或推薦進行臨床試驗。早期患者的療效較好，但是進展期患者療效差，特別是ⅡB期以上的Sézary綜合征(SS)和蕈樣霉菌病(MF)患者，中位生存時間僅1～4年〔3〕。在CTCL系統化療中，單藥氟達拉濱、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤及聯合用藥如:環磷酰胺+阿霉素+長春新堿+潑尼松(CHOP)、環磷酰胺+長春新堿+潑尼松(COP)、依托泊苷+潑尼松+長春新堿+環磷酰胺+多柔比星(EPOCH)等方案，雖取得了一定的療效，但腫瘤易耐藥，緩解期短。吉西他濱是阿糖胞苷的衍生物，屬于細胞周期特異性藥物，目前廣泛應用于PTCL的治療，2008年NCCN指南將吉西他濱列入CTCL的二線系統治療中，但總的無進展生存期或緩解期仍不理想〔1，4〕。

培美曲塞為多靶點葉酸拮抗劑，能抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、甘氨酸核糖核苷甲酰基轉移酶等葉酸依賴性酶，廣泛應用于各種腫瘤的治療中。Chun等〔5〕報道培美曲塞能抑制胰腺癌細胞的增殖，與吉西他濱聯合具有協同作用，且先用培美曲塞后用吉西他濱對細胞增殖的抑制作用更強。Tonkinson等〔6〕報道吉西他濱與培美曲塞聯合應用于人結腸癌細胞(HT29)存在時序效應，先用培美曲塞后用吉西他濱對細胞增殖的抑制作用更強。Li等〔7〕研究埃羅替尼與培美曲塞聯合應用于非小細胞肺癌，先用埃羅替尼后用培美曲塞，對埃羅替尼敏感的細胞產生拮抗作用;同時給藥或先用培美曲塞后用埃羅替尼，對埃羅替尼敏感或不敏感的細胞均產生協同作用。以上提示研究聯合培美曲塞抗腫瘤治療可能存在不同的時序效應。

本研究提示吉西他濱與培美曲塞單藥以及不同時序聯合應用均可抑制HUT-78增殖，促進凋亡，作用大小與應用時序有關，先用培美曲塞后再用吉西他濱的作用最強。

本實驗由于載體動物體內實驗的復雜性，與體外細胞學實驗存在一定差異，而且CTCL是一組具有明顯異質性的疾病，因此有必要此進一步探討多種PTCL細胞株體內外實驗研究，進一步明確藥物作用機制、聯合用藥時序。

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5 Chun PY，Feng FY，Scheurer AM，et al.Synergistic effects of gemcitabine and gefitinib in the treatment of head and neck carcinoma〔J〕.Cancer Res，2006;66(2):981-8.

6 Tonkinson JL，Worzalla JF，Teng CH，et al.Cell cycle modulation by a multitargeted antifolate，LY231514，increases the cytotoxicity and antitumor activity of gemcitabine in HT29 colon carcinoma〔J〕.Cancer Res，1999;59(15):3671-6.

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