林蛙卵油通過影響Bcl-2蛋白質家族抑制卵巢凋亡的機制

高 銳 苑春莉 孫連坤 王 玲 康勁松

(吉林大學第一醫院婦產科，吉林 長春 130021)

中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)是兩棲綱、無尾目、蛙科、蛙屬動物，其干燥輸卵管稱為林蛙油，是一種名貴食療性中藥。近年來的研究顯示由提取林蛙油剩余的卵以及由卵提取的林蛙卵精油的保健價值更高〔1，2〕。本研究旨在分析林蛙卵油對于大鼠卵巢凋亡指數和Bcl-2和Bax表達的影響，分析林蛙卵油對卵巢細胞凋亡的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 雄激素處理模型制作及分組 選擇9日齡Wistar清潔雌性大鼠50只，其中模型組40只，丙酸睪丸酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射，建立丙酸睪丸酮誘導的卵巢損傷大鼠模型;正常對照組10只，同期生理鹽水皮下注射〔3，4〕。分為高劑量(1.0 g/d)組、中劑量(0.4 g/d)組、低劑量(0.1 g/d)組，模型組和正常對照組，每組10只，各組在造模成功后喂養110 d至成年。模型組和正常對照組用生理鹽水3 ml/d灌胃;林蛙卵油各劑量組應用林蛙卵油灌胃，用生理鹽水稀釋至3 ml，灌胃15 d后處死大鼠。采出右側卵巢放入甲醛溶液固定，左側卵巢立即放入 －70℃冰箱中速凍〔3，4〕。

1.2 Tunnel檢測 Tunnel試劑盒購自Sigma公司，DAB顯色試劑盒購自Sigma公司。用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(S-P法)染色。

1.3 Western印跡法檢測 按照常規方法進行，蛋白提取、配制分離膠和濃縮膠、加樣、電泳、切膠、轉膜、封閉、加入一抗、加入二抗、顯色、記錄。

1.4 結果制定 Tunnel染色陽性為細胞核出現棕黃色顆粒。凋亡指數(AI)計算方法:隨機選擇10個凋亡腫瘤細胞數占所有腫瘤細胞數的百分比(細胞凋亡%=凋亡的細胞數/細胞總數 ×100%)。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 Tunnel免疫組織化學染色結果 模型組的凋亡指數(43% ±1.97%)較正常對照組(22% ±0.92%)升高，給予林蛙卵油后，凋亡指數降低。正常對照組與模型組有顯著差異(P＜0.05)，中劑量組(30% ±0.74%)和高劑量組(31% ±0.96%)與模型組有顯著差異(P＜0.05)，低劑量組(39% ±1.12%)與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 Western印跡結果 隨著藥物劑量增加，Bax表達降低，Bcl-2表達增加。與模型組比較，中劑量組和高劑量組的灰度值變化有顯著差異(P＜0.05)。見圖1和表1。

表1 各組大鼠Bcl-2、Bax的灰度值比(n=10)

3 討論

林蛙卵中含有多種微量元素、維生素、不飽和脂肪酸、磷脂、氨基酸，富含雌二醇、孕酮〔1，2〕。林蛙卵油具有溫和的降低血脂，軟化血管，抑制血小板聚集、改善血液流變學特征、抑制血脂沉積作用〔5〕;有一定的中樞抑制作用〔6〕，有明顯的增強機體抗脂質過氧化損傷，調節免疫的抗衰老的生物作用〔7〕，而且沒有明顯毒副反應。

細胞凋亡是細胞的一種具有形態學變化而不同于細胞壞死的死亡方法，凋亡在卵巢退化中發揮作用，存活前和凋亡前因子在卵巢凋亡過程中發揮作用，其間的精細調節對于卵巢的最終命運發揮了決定性作用:卵泡閉鎖過程主要有Bcl-2家族成員、腫瘤壞死因子(TNF)和Caspases參與;排卵有Bcl-2，Bax，卵泡刺激素(FSH)，抑制素(inhibin)，Fas配體，caspases等參與〔8〕。我們制造的雄激素大鼠模型在形態學和部分內分泌學特性上符合多囊卵巢綜合征的特點，其形態學特征表現為卵泡閉鎖和持續不排卵〔3，4〕。本文結果說明雄激素可以促進卵巢凋亡，給予林蛙卵油灌胃后降低卵巢細胞的凋亡的發生，起到保護卵巢的作用。該保護作用有一定的劑量依賴性，需要林蛙卵油濃度達到一定程度。

B細胞淋巴瘤-2蛋白質家族包括存活前因子(Bcl-2，Mcl-1和Bcl-XL等)和凋亡前因子(Bax，Bcl-2相關X蛋白等)。Bcl-2是一種存活前因子，它定位于核膜和線粒體，它通過調節線粒體釋放細胞色素C和Apaf-1和caspases-9的相互作用，與Bax結合，阻止由c-Myc引起的凋亡發揮抑制凋亡功能。Bax是凋亡前因子，定位于細胞質或細胞膜，對抗Bcl-2的防護作用。Bcl-2主要在發育卵泡中表達，Bax主要在閉鎖卵泡中表達〔9，10〕。

本實驗證實給予雄激素均使得卵巢前存活因子Bcl-2表達降低，而前凋亡因子Bax表達增加，提示雄激素增強了卵巢細胞的凋亡。給予林蛙卵油灌胃后，前存活因子Bcl-2表達有升高趨勢，而前凋亡因子Bax表達有降低趨勢，差異均有顯著性，提示林蛙卵油可以通過影響Bcl-2蛋白質家族抑制卵巢細胞的凋亡，發揮保護卵巢的作用。

1 苑春莉，孫連坤，康勁松.林蛙卵油灌胃對于雄激素預處理大鼠婦科內分泌的影響〔J〕.中國實驗診斷學，2010;14(2):196-8.

2 苑春莉，盛 輝，孫連坤，等.林蛙卵油灌胃對于雄激素預處理大鼠卵巢凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(17):2451-2.

3 王 宇，尚德靜，馮伯森.中國林蛙蛙卵營養成分分析〔J〕.遼寧師范大學學報(自然科學版)，2004;27(4):471-3.

4 杜景新，王 麗，李春慧，等.林蛙油、林蛙卵油的成分及開發利用〔J〕.人參研究，2003;3(5):18-9.

5 彭 飛，徐 峰，劉 彬，等 中國林蛙卵油對高脂血癥大鼠降脂作用的觀察，醫學理論與實踐，2003;16(9):996-7.

6 彭 飛，韋媛媛，佟 巖，等.中國林蛙卵油抗的士寧驚厥的機制〔J〕.沈陽藥科大學學報，2005;22(5):386-9.

7 彭 飛，徐 峰，趙 倩，等.中國林蛙卵油的抗驚厥作用及其與單胺神經遞質的關系〔J〕.中國藥學雜志，2005;40(12):912-5.

8 Matsuda F，Inoue N，Manabe N，et al.Follicular growth and atresia in mammalian ovaries:regulation by survival and death of granulosa cells〔J〕.JReprod Dev，2012;58(1):44-50.

9 Abir R，Orvieto R，Dicker D，et al.Preliminary studies on apoptosis in human fetal ovaries〔J〕.Fertil Steril，2002;(78):259-64.

10 Hsu SY，Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm〔J〕.Physiol Rev，2000;80(2):593-614.