大鼠肝癌發生過程中α-SMA及AFP動態變化

楊 智 符碧薇 江朝娜 藍永洪

(海南醫學院形態學實驗室，海南 海口 571101)

甲胎蛋白(AFP)常常作為臨床診斷原發性肝癌的一個臨床指標〔1〕。肝纖維化與肝癌的發生有著密切的關系，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的增加與肝纖維化有著密切關系〔2〕，因此α-SMA也用來輔助診斷原發性肝癌。本研究通過建立大鼠肝癌模型，研究大鼠肝癌進展過程中α-SMA和AFP的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體重160～200 g，約10周齡，購自于河北醫科大學實驗動物中心實驗中心，寄養于潔凈動物房內，給予自由飲水和標準飲食。

1.1.2 實驗試劑 二乙基亞硝胺(美國Sigma公司)，鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(上海億欣生物試劑公司)，DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，山羊血清(上海恒遠生物科技有限公司)，染色液(湖北泰康醫療設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝癌模型的建立 選取SD大鼠65只，隨機分為對照組21只，整個實驗過程中均飲用滅菌食用水。實驗組35只，前4 w飲用滅菌食用水配置的二乙基亞硝胺，濃度100μg/ml，連續飲用4 w后，改飲普通滅菌食用水。與此同時另取9只SD大鼠，處理方法同實驗組，作為實驗備用組，用于作為實驗組動物中途死亡的補充。

1.2.2 大鼠肝癌模型的病變過程 實驗過程中，觀察實驗組和對照組大鼠的生存狀況，并分別在第6，8，10，12，14，16，18 周處死5只實驗組和3只對照組大鼠，取肝組織進行病理學檢查，觀測大鼠肝癌模型的進展狀況。對所取組織常規行10%甲醛固定、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后進行病理組織學檢查。

1.2.3 大鼠肝臟組織中α-SMA的表達 將上述取得的各組大鼠的組織立即固定，石蠟包埋制成切片，采用免疫組化技術測定大鼠肝臟組織中α-SMA的表達。結果分為:(－)陰性;(+)弱陽性;(?)陽性和(?)強陽性。

1.2.4 血清中AFP的檢測 實驗過程中在第6，8，10，12，14，16，18周處死大鼠時，分別取大鼠的血，離心取血清，按照試劑盒的操作規范，使用ELISA法分別檢測AFP的水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件，所有數據均以表示，采用t檢驗，制圖采用Graphpad Prism 5.0軟件。

2 結果

2.1 各組大鼠的生存狀況 對照組大鼠無異常現象，食欲良好，活動自如，無自然死亡。實驗組大鼠在實驗前期(前6 w)，與對照組無明顯變化，隨著實驗時間的增加(8～18 w)，實驗組部分大鼠出現食欲不振，活動減少狀況，并在實驗過程中出現實驗大鼠死亡2例，死亡率5.71%，死亡大鼠又實驗備用組大鼠補充繼續試驗。

2.2 大鼠肝癌模型的病變過程 在第 6，8，10，12，14，16，18周處死5只實驗組和2只對照組大鼠，分別取出大鼠的肝臟，稱取大鼠肝臟的重量。對照組大鼠從第6～18周，肝臟的重量只有少量增加;而實驗組從第6～18周增加明顯。并且從第10周開始，實驗組大鼠肝臟的重量與對照組大鼠肝臟的重量相比，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，實驗組大鼠肝臟的重量明顯重于對照組大鼠。見表1。

肝組織的電鏡圖顯示，對照組大鼠肝組織結構正常，細胞排列規則。實驗組大鼠6、8 w大鼠肝組織出現纖維化;第10周開始出現肝硬化，有假小葉產生，為肝癌初發期;第12、14周出現肝細胞異性，產生肝癌結節為早期肝癌現象;第16、18周出現肝癌細胞向正常組織浸潤生長，為肝癌晚期癥狀。見圖1。

2.3 大鼠肝臟組織中α-SMA的變化 對照組大鼠α-SMA在第6～18周在肝臟組織中基本不表達，或表達極弱。而實驗組大鼠第6周表達極弱呈陰性(－);第8～10周肝癌初發時期，表達量有所增加，呈弱陽性(+);第12～14周早期肝癌，α-SMA表達呈陽性(?);第16～18周晚期肝癌期，α-SMA表達呈強陽性(?)。

2.4 血清AFP的變化 對照組大鼠在第6～18周，血清AFP濃度基本上無變化;實驗組大鼠在第6～18周內，血清AFP濃度逐漸增大，且實驗組大鼠在第 10、12、14、16、18周與相應時間的對照組相比差異顯著(P＜0.05)。見圖2。

表1 各組大鼠在肝癌進展過程中的肝臟重量，g)

表1 各組大鼠在肝癌進展過程中的肝臟重量，g)

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3 討論

由于原發性肝癌是我國致死率較高的惡性腫瘤之一，因此建立完善的診斷標準十分緊迫。我國目前使用的是由中國抗癌協會制定的診斷標準，血清AFP含量以及結合影像學資料作為重要的指標〔4〕，但隨著科技進步以及經驗的積累發現現有的診斷標準尚有不足之處。但血清AFP含量作為原發性肝癌的診斷標準目前已發現有假陽性和假陰性〔5〕，因此尚需結合各種新的肝癌標記物綜合診斷。因此為了臨床更準確的診斷原發性肝癌，我們進行研究以期發現新的原發性肝癌標記物。

本研究采用的建立大鼠肝癌模型的方法，成功率高，為臨床研究原發性肝癌提供新的思路。綜上所述，根據本研究發現α-SMA及AFP含量的隨著肝癌的進展逐漸增加，因此α-SMA結合AFP作為診斷指標更能準確地診斷原發性肝癌。

1 王麗娜，鞠吉雨，鄭 潔，等.AFP-L3、HSP70及AFP水平在大鼠肝癌發展中的動態變化〔J〕.中國醫藥導報，2010;7(22):13-5.

2 季巍巍，宋育林，路 燕.非酒精性肝纖維化 a-SMA、E-鈣黏素和Twist1的變化及意義〔J〕.安徽醫藥，2012;16(5):588-91.

3 劉 揚，吳孟超，錢光相，等.血液AFP mRNA在復發性肝癌及伴有肝外遠處器官轉移的原發性肝癌中的診斷意義〔J〕.第二軍醫大學學報，1999;20(3):192-3.

4 孟憲鏞.肝癌標記物研究進展〔J〕.國外醫學·內科學分冊，1999;17(2):54-8.