鹽酸小檗堿對高糖、高脂聯合誘導內皮細胞分泌TNF-α的干預作用

邵明柏 何秀婷 李 杰

(吉林大學第一醫院老年干部科，吉林 長春 130021)

內皮細胞功能的紊亂是糖尿病血管并發癥早期的重要特征〔1〕。有研究表明，炎癥因子在糖尿病血管內皮損傷機制中發揮重要的作用〔2，3〕。近年研究表明，鹽酸小檗堿(黃連素)能夠降血糖、降血脂，改善胰島素抵抗，對糖尿病具有很好的療效〔4〕。本研究通過觀察黃連素對高糖、高脂損傷的內皮細胞增殖率、一氧化氮(NO)、內皮素1(ET-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌的影響，初步探討其對高糖、高脂損傷的內皮細胞的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 黃連素購于中國藥品檢驗所，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL):北京欣源佳和生物科技有限公司，胎牛血清(FCS):美國，培養基DMEM、胰蛋白酶:美國Gibco公司，噻唑藍(MTT):Sigma公司，二甲亞砜(DMSO):北京拜爾迪公司。NO、ET-l測定試劑盒:南京建成生物工程研究所，TNF-α ELISA試劑盒:北京博奧森。酶標儀、超低溫冰箱、CO2培養箱:日本三洋公司，紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司，高壓滅菌鍋:上海申安醫療器械廠，離心機:上海手術器械廠，倒置顯微鏡:日本OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的培養與鑒定 以0.1%膠原酶消化法分離內皮細胞，用完全M199〔含20%FCS，20 mg/L血管內皮細胞增長因子(ECGF)〕接種細胞于培養瓶(預先用0.4%明膠包被)，置37℃、5%CO2孵箱培養，當細胞融合成單層時，以0.125% 胰酶-0.02%乙二胺四乙酚(EDTA)消化傳代，實驗用第2～4代。用第Ⅷ因子相關抗原檢測(SP免疫細胞化學染色法)陽性鑒定內皮細胞。

1.2.2 葡萄糖(Glu)+ox-LDL損傷HUVECs模型的建立 取對數生長期細胞，調整細胞數為5×104/ml，每孔200 ml接種于96孔培養板，每組設6個平行孔。將Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L培養細胞24～48 h，MTT檢測，計算細胞存活率，建立Glu+ox-LDL損傷HUVECs模型。

1.2.3 MTT法檢測黃連素對HUVECs增殖的影響 將細胞懸液按每孔1×105個細胞接種于96孔細胞培養板，在37℃、5%CO2的培養箱中培養數小時使細胞貼壁。培養細胞待細胞貼壁且狀態良好，生長至 70% ～80%融合時，換含不同濃度Glu+ox-LDL培養基或含不同濃度Glu+ox-LDL+黃連素培養液，Glu+ox-LDL及黃連素儲存液分別用培養基稀釋至所需濃度。根據實驗設計進行分組，每組設6個平行孔，每孔加培養液200μl，置于CO2培養箱中，37℃繼續培養 24～48 h。每孔加入MTT溶液20μl，37℃繼續孵育4 h，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min，使藍色結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定吸光值(OD)，取其平均值，計算細胞存活率。每項實驗至少重復3次。細胞存活率=處理組細胞的OD平均值/對照組細胞的OD平均值×100%。

1.2.4 細胞培養上清中NO、ET-1和TNF-α的檢測 將傳代培養的細胞接種在96孔培養板中，分為五組:對照組:DMEM培養液 +10%胎牛血清;模型組:Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L;Glu+ox-LDL+黃連素1.25μg/ml;Glu+ox-LDL+黃連素2.5μg/ml;Glu+ox-LDL+黃連素5.0μg/ml，每組6個復孔。待細胞生長近70%融合時換為含有2%FCS的DMEM或含Glu+ox-LDL的培養基，同時加入各處理因素，孵育24 h，吸取細胞培養上清液，按照試劑盒說明進行NO、ET-1和TNF-α測定，根據公式計算出樣本中所含NO、ET-1和TNF-α含量。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，數值變量資料采用表示。

2 結果

2.1 Glu+ox-LDL損傷HUVECs模型的建立 MTT法檢測發現，Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L對HUVECs的損傷具有時間依賴性。Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L培養HUVECs 24 h，細胞存活率為(70.52±3.11)%(P＜0.05)，培養48 h細胞存活率降至(61.25±4.89)%(P＜0.05)。而不含Glu+ox-LDL的培養液對細胞無明顯損傷，培養24 h細胞存活率為(97.24±1.66)%，培養48 h細胞存活率為(96.57±1.39)%。由此認為Glu 40 mmol/L+ox-LDL 100 mg/L培養24 h作為建立Glu+ox-LDL損傷HUVECs模型的條件。

2.2 黃連素對Glu+ox-LDL培養HUVECs存活率的影響 模型組〔(68.31±3.45)%〕培養 HUVECs 24 h，與對照組〔(98.12±1.99)%〕比較細胞存活率降低(P＜0.01)，同時應用 1.25、2.5、5.0μg/ml黃連素治療，細胞存活率提高〔(14.19±2.06)、(76.35±2.67)、(79.69±2.34)%〕。但黃連素處理后各劑量組細胞存活率均未達到對照組水平。

2.3 黃連素對Glu+ox-LDL聯合誘導損傷下HUVECs上清液中NO、ET-1含量的影響 與對照組比較，模型組HUVECs細胞NO釋放量顯著降低(P＜0.01);而黃連素各治療組能不同程度地提高NO含量，其中黃連素5μg/ml提高NO分泌作用最強，與模型組比較 P＜0.01。模型組ET-1比對照組顯著增高(P＜0.01)，說明造模成功;黃連素各治療組比模型組明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.4 黃連素對Glu、ox-LDL聯合誘導損傷下內皮細胞培養液中TNF-α的影響 對照組與模型組內皮細胞培養液中TNF-α水平差別有統計學意義(P＜0.01)，說明造模成功;黃連素各治療組比模型組內皮細胞培養液中TNF-α明顯降低(P＜0.01)，但仍高于對照組(P＜0.01)。見表1。

表1 黃連素對Glu、ox-LDL聯合損傷HUVECs上清液中NO 、ET-1、TNF-α含量的影響(n=6

表1 黃連素對Glu、ox-LDL聯合損傷HUVECs上清液中NO 、ET-1、TNF-α含量的影響(n=6

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

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3 討論

糖尿病時異常血糖損害內皮細胞的形態和功能而導致糖尿病血管病變的發生〔5〕。本實驗結果表明:Glu 40 mmol/L、ox-LDL 100 mg/L在培養48 h以上抑制HUVECs的增殖，且48 h較明顯。黃連素濃度在5、2.5μg/ml可對抗高 Glu、ox-LDL抑制HUVECs的增殖作用，使細胞增殖率從損傷后的較低水平恢復到接近正常水平。

NO是內皮細胞產生的一種血管保護因子，由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸產生。生理情況下，血管內皮中主要由eNOS催化產生NO。糖尿病伴血管損傷時，iNOs表達增加，高血糖可誘導iNOS表達，激活后的iNOS活性持續時間長，催化生成NO的量遠遠大于nNOS和eNOS催化產生NO的量。其結果使內皮細胞中NO合成增加〔6〕。本試驗結果提示機制可能是:在損傷48 h內eNOS途徑受損，而iNOS途徑尚未激活，從而使NO含量明顯降低。黃連素干預后，NO含量增加，提示黃連素可上調NO，并通過與相應受體結合，促進cGMP的合成，同時抑制細胞Ca2+內流，增高細胞膜K+通道的活性，而使血管平滑肌松弛、抗平滑肌增殖、抗血小板凝集以阻抑動脈粥樣硬化而對2型糖尿病(T2DM)血管病變有益。

ET-1作為NO的拮抗劑，是由21個氨基酸構成的一種強烈而持久的血管收縮劑，主要由血管內皮細胞合成，它的穩定表達對維持血管的基礎張力至關重要，其水平升高可使血管痙攣從而促使血栓形成并誘發動脈粥樣硬化，對心腦血管疾病及糖尿病的血管并發癥具有重要作用〔7，8〕。在T2DM血管內皮細胞受到物理和細胞因子的刺激，促使ET的合成和釋放，使血漿ET水平增強。這種改變參與了動脈粥樣硬化的發生、發展，并與動脈粥樣硬化的程度與范圍明顯相關。本研究結果顯示，在Glu、ox-LDL混合條件液下培養HUVECs 48 h后，ET-1含量增高，而使NO生物利用度下降，使細胞受到更嚴重的氧化損傷，且打破ET/NO的平衡，造成內皮細胞的舒縮障礙〔2〕，給予黃連素治療后，ET-1含量降低，其可能機制是黃連素通過增加NO的含量，降低炎癥因子的分泌，而降低ET-1的分泌。

TNF-α是兩種重要的促炎性細胞因子，除誘導自身表達外還可誘導血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、巨噬細胞集落刺激因子(MZCSF)、細胞黏附分子、原癌基因、凋亡相關基因等的表達，造成血管內皮細胞損傷，促進血管平滑肌細胞增殖，引起動脈粥樣硬化而導致T2DM的血管并發癥。本研究結果表明Glu、ox-LDL混合條件液下HUVECS培養液中TNF-α含量增加。給予黃連素治療后TNF-α含量降低。其機制有待進一步研究。

綜上，本實驗證實了鹽酸小檗堿具有保護內皮細胞作用，其作用機制可能與其調節內皮NO/ET-1平衡、抗炎作用有關。

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5 張 卓，王春梅，王春艷.鹽酸小檗堿對糖尿病大鼠胸主動脈內皮損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(12):1654-7.

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