康腦液對腦缺血大鼠Fas、Caspase-3蛋白表達的影響

馬 倩 耿 倩 薛 茜 鄒玉安

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

缺血性腦血管病(ICVD)患者總人數可達500萬～600萬，存活者有約75%的高致殘率〔1〕。目前認為凋亡是遲發性腦死亡的主要形式，凋亡在腦缺血再灌注損傷發病機制中發揮著重要作用。本實驗通過觀察康腦液對腦缺血再灌注(I/R)大鼠的保護作用，從細胞凋亡因子Fas、Caspase-3蛋白表達的角度研究其作用機制，為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 康腦液:由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等組成，藥材購于河北北方學院附屬第一醫院，冷水浸泡30 min，文火煎煮3次，每次15 min，濾出藥渣，將2次煎取的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液(每毫升含生藥4 g、2 g、1 g)，最后4℃冰箱保存備用。依達拉奉注射液，規格:20 ml/30 mg，批號:061218，南京先聲東元制藥有限公司提供，4%多聚甲醛，購自美國 Sigma公司。兔抗大鼠 Fas、Caspase-3一抗體及相應二抗(江蘇鎮江生物技術有限公司)。

1.2 實驗儀器 自動脫水機(美國Thermo)，電腦生物組織包埋機(浙江金華科迪)，石蠟切片機(美國Thermo)，電腦生物組織攤烤片機(浙江金華科迪)，光學顯微鏡(日本OLYMPUSBX60型)，顯微攝影裝置(日本NIKON)。

1.3 實驗動物分組及給藥 SPF級雄性SD大鼠126只，體重200～280 g，購自北京大學醫學部動物中心〔許可證號SCXK(京)2006-0008〕。隨機分為:假手術組、模型組、依達拉奉組(2.7 mg/kg)、康腦液高(24.0 g·kg－1·d－1)、中(12.0 g·kg－1·d－1)、低(6.0 g·kg－1·d－1)劑量組，假手術組 6 只，其余各組每組24只，術前7 d開始灌胃給藥，最后一次給藥后60 min實施腦I/R手術，每天早晨給藥1次，術后繼續給藥，直至處死。給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，假手術組及模型組灌等體積蒸餾水。采用改良Longa線栓法，制備大鼠右側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型。

1.4 Fas、Caspase-3蛋白檢測 各組大鼠分別于再灌注時間點后取腦，7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，首先用0.9%生理鹽水150 ml心臟灌注，直至沖出的液體變清亮后立即換用4%多聚甲醛心臟灌注固定，大鼠全身僵硬后快速斷頭取腦，從前向后將腦組織分為5等分，切成2～3 mm的腦片，4%多聚甲醛固定液中繼續固定24 h。常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。切片3μm，采用免疫組織化學(S-P二步法，按說明操作)檢測Fas、Caspase-3蛋白表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0進行處理，每組數據以表示。各指標組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠腦組織Fas蛋白表達結果 光鏡下(×400)在梗死周邊區隨機選取5個互不重疊視野，計數陽性細胞數。免疫組化染色顯示，Fas主要分布在細胞質，著色為棕黃色。與假手術組比較，模型組Fas蛋白表達水平均顯著上調(P＜0.01)。與模型組比較，康腦液各組、依達拉奉組Fas蛋白表達明顯下降(P ＜0.01，P ＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達結果 光鏡下(×400)在梗死周邊區隨機選取5個互不重疊視野，計數陽性細胞數。免疫組化染色顯示，Caspase-3主要分布在細胞質，著色為棕黃色。與假手術組比較，模型組Caspase-3蛋白表達水平均顯著上調(P＜0.01)。與模型組比較，康腦液各組、依達拉奉組Caspase-3蛋白表達明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。見表2，圖2。

表1 各大鼠Fas的表達結果(n=6

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

?

表2 各組大鼠Caspase-3的表達結果(n=6

表2 各組大鼠Caspase-3的表達結果(n=6

?

3 討論

I/R損傷涉及許多復雜的級聯反應，包括許多環節，如興奮性氨基酸的毒性作用，細胞內Ca2+超載、線粒體功能障礙、炎性介質的釋放，凋亡基因的表達等〔2〕。這些因素緊密聯系，互為因果、最終導致神經細胞凋亡或壞死。細胞凋亡是神經元細胞的主要死亡方式，其中促凋亡因子Fas、Caspase-3的表達與凋亡關系密切。Fas參與了腦缺血再灌注的病理生理過程〔3〕。Caspase-3的活化在細胞凋亡過程中起著關鍵作用，因此抑制Caspase-3蛋白表達可阻斷細胞凋亡的瀑布反應。本研究結果顯示，假手術組各時間點大鼠Fas和Caspase-3陽性細胞數表達不明顯。在壞死邊緣區，模型組各時間點Fas和Caspase-3細胞數不同程度增加。康腦液各組能減少梗死灶周邊細胞Fas和Caspase-3表達，因此可以促進神經元的恢復。

從中醫角度來講腦血管病的主要病機為“氣虛血瘀”，治療原則應以“益氣活血化瘀”為主。康腦液為臨床經驗方，由補陽還五湯化裁而來，由黃芪、丹參、鉤藤、三七粉等組成，具有益氣活血化瘀、清熱平肝、熄風定驚的作用。研究證實益氣活血法〔4，5〕對缺血性腦血管病能夠起到治療作用。張運克等〔6〕證實補陽還五湯能夠抑制細胞凋亡，從而保護腦組織。各單藥黃芪〔7〕，鉤藤〔8〕，三七〔9〕等有不同的治療腦梗死的作用，因此研究康腦液的作用機制給腦血管病患者帶來了希望。

綜上，康腦液通過抑制早期Fas蛋白的表達，進而阻斷Caspase-3引起的凋亡瀑布反應，從而保護腦組織。

1 Jia Q，Liu LP，Wang YL.Stroke in China〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010;37(2):259-64.

2 李 涵，陳 萌.腦缺血再灌注損傷后神經元損傷機制的研究進展〔J〕.承德醫學院學報，2007;24(4):413-5.

3 吳 剛，薛榮亮，呂建瑞，等.全腦缺血再灌注后Fas、TNFR1蛋白的表達與細胞凋亡的關系及Bcl-2過度表達對其的影響〔J〕.南方醫科大學學報，2011;31(8):1298-303.

4 李 凈，王 鍵，胡建鵬，等.益氣活血法對氣虛血瘀腦缺血再灌注損傷大鼠一氧化氮含量和神經細胞凋亡的影響〔J〕.中國中醫基礎醫學雜志，2007;13(12):898-900.

5 劉學源.益氣活血法治療急性缺血性腦血管病的實驗研究〔J〕.中國中醫藥現代遠程教育，2010;8(15):9-11.

6 張運克.補陽還五湯及拆方對腦缺血再灌注SD大鼠模型細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2007;22(6):404-7.

7 任 非，龔淑英，智麗敏，等.黃芪治療缺血性腦損傷的有效性〔J〕.中國臨床康復，2006;10(3):149-51.

8 唐映紅，張淑萍，梁 燕，等.三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注后白細胞介素21β和其相關因子及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶表達的影響〔J〕.中西醫結合學報，2007;5(3):328-32.

9 高麗娜，宋 宇，徐 薇，等.鉤藤堿對缺血再灌注誘導大鼠星形膠質細胞損傷的作用〔J〕.藥學與臨床研究，2009;17(1):1-4.