Ghrelin在杏仁中央核內對大鼠攝食的調節

朱永香 王 倩 王 爽 于 瑋 南 瑛 曹 健

(西安醫學院生理學教研室，陜西 西安 710021)

Ghrelin是由28個氨基酸殘基組成的多肽，具有強烈的促食欲作用。最初發現Ghrelin主要是由胃底泌酸腺的X/A樣細胞產生，但后來Cowley等〔1〕報道腦內尤其是下丘腦也能夠合成Ghrelin，而其陽性突起在下丘腦以外的腦區也有分布，包括:杏仁中央核(CeA)、終紋床核、內側杏仁核、杏仁皮質核以及丘腦室旁核等部位。生長激素促分泌素受體(GHS-R)是Ghrelin在中樞神經系統內發揮作用的受體，在中樞神經系統的分布包括下丘腦、腦干以及邊緣系統的一些腦區〔2〕。盡管最初并未發現CeA內有GHS-R的存在，但近來有研究用qRT-PCR方法檢測到CeA內有GHS-R mRNA存在〔3，4〕。CeA是參與攝食行為調節的核團之一，已有研究證實下丘腦外側區或室旁核注射Ghrelin激活了CeA內的神經元〔5，6〕。然而，至今并未發現Ghrelin在CeA內對攝食調節作用的研究。本研究應用核團內注射的方法觀察了給飽食大鼠CeA內注射Ghrelin對攝食量的影響及對弓狀核c-Fos表達的影響;并觀察了給隔夜禁食大鼠CeA內注射GHS-R阻斷劑D-Lys3-GHRP-6對攝食量的影響，擬探討外源性及內源性Ghrelin在CeA內對攝食的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 48只雄性 SD大鼠，體質量220～240 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，生產許可證:SCXK(陜)2008-002，使用許可證:SYXK(陜)2008-005。大鼠自由攝食飲水，室溫22～24℃。多克隆兔抗大鼠c-Fos抗體購自美國Santa Cruz公司，Ghrelin和GHS-R受體阻斷劑D-Lys3-GHRP-6均購自美國Sigma公司，SP試劑盒(羊抗兔)及DAB濃縮型試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器有大鼠腦立體定位儀(SN-3)、顯微鏡(Olympus，BX51)、照相機(Spot Insight，U3.5)及圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)。

1.2 CeA內植入套管 將大鼠腹腔注射水合氯醛(40 mg/kg)麻醉，固定于立體定位儀上，將自制鋼套管植入左側CeA上方1 mm處(根據包新民大鼠腦立體定位圖譜:前囟后2.2 mm，向左旁開4.5 mm，硬腦膜下6.5 mm)，并用牙科水泥固定。術后恢復8 d，痊愈后實驗，狀態差者排除實驗。

1.3 飽食大鼠CeA內注射Ghrelin后攝食量的觀察 將16只術后大鼠隨機分為兩組，每組8只，自由攝食，分別用微量注射器向CeA內注射(在套管下1.0 mm處持續2 min，停留2 min)生理鹽水(對照組)或Ghrelin 0.3 nmol(實驗組)，分別測量1、2、4 h內大鼠的攝食量。

1.4 飽食大鼠CeA內注射Ghrelin后弓狀核內c-Fos表達的觀察 將16只手術后大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組8只并自由攝食，分別用微量注射器向CeA內注射生理鹽水(對照組)或Ghrelin 0.3 nmol(實驗組)，2 h后灌流固定，斷顱取腦固定后，做冰凍冠狀切片，片厚40μm。SP免疫組織化學染色檢測弓狀核內c-Fos蛋白的表達。細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達。在400倍光鏡下，選取有弓狀核的連續5張切片，并選取同一區域拍照，應用IPP6.0軟件分析FOS陽性細胞數。

1.5 隔夜禁食大鼠CeA內注射GHS-R阻斷劑后攝食量的觀察 將16只手術后大鼠隨機分為2組，每組8只，隔夜禁食后，分別用微量注射器向CeA內注射生理鹽水(對照組)或GHS-R阻斷劑D-Lys3-GHRP-6 200 nmol(實驗組)后，測量1、2及4 h內大鼠的攝食量。

1.6 套管位置鑒定 實驗結束后用20%烏拉坦(1 mg/kg)腹腔注射麻醉，CeA內注入旁胺天藍0.5μl，灌流固定，開顱取腦，置入10%甲醛中后固定。24 h后做連續冰凍冠狀切片，片厚50μm，光鏡下參照大鼠腦定位圖譜對套管位置進行定位，排除位置不準確的數據。

1.7 統計學分析 采用SPSS18.0統計學軟件分析數據，實驗數據采用表示，組間比較采用t檢驗。

表2 隔夜禁食大鼠CeA內注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化，mg，n=8)

表2 隔夜禁食大鼠CeA內注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化，mg，n=8)

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圖1 大鼠弓狀核內c-Fos免疫組織化學染色結果(SP，×400)

2 結果

2.1 飽食大鼠CeA內注射Ghrelin后攝食量的變化 實驗組與對照組比較，1、2、4 h內的攝食量明顯增加(P＜0.05)。見表1。

表1 CeA內注射Ghrelin后攝食量的變化，mg，n=8)

表1 CeA內注射Ghrelin后攝食量的變化，mg，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;表2同

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2.2 飽食大鼠CeA內注射Ghrelin后弓狀核內c-Fos表達的變化 對照組弓狀核內c-Fos免疫反應陽性細胞表達較少，平均值為46.13±9.14，實驗組弓狀核內c-Fos免疫反應陽性細胞表達較多，平均值為93.88±21.09，與對照組比較差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

2.3 隔夜禁食大鼠CeA內注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化 實驗組與對照組相比，1、2、4 h內的攝食量明顯減少(P＜0.05)。見表2。

3 討論

Ghrelin是GHS-R的內源性配體，具有強烈的刺激攝食的作用。盡管胃是血液循環中Ghrelin的主要來源，并且外周注射Ghrelin可以產生強烈的攝食反應。然而，中樞神經系統對Ghrelin的攝食調控發揮著至關重要的作用。給大鼠下丘腦的多個核團內如:弓狀核、下丘腦外側區、下丘腦室旁核以及腦干注射Ghrelin均可發動攝食行為;另外，給中腦腹側被蓋區、伏核、海馬以及中縫背核注入Ghrelin同樣也出現了刺激攝食的作用〔7，8〕。由于Ghrelin突起及其受體GHS-R在CeA內均有存在〔1，3，4〕，并且 CeA 對攝食具有調控作用，可增加進食量，有理由推測Ghrelin在CeA內可能同樣參與了攝食調節作用。

當機體處于饑餓狀態時，下丘腦內GHS-R mRNA表達上調，血漿中Ghrelin濃度升高，餐后血漿中Ghrelin水平降低。本研究結果提示Ghrelin在CeA內的生物學效應具有促進攝食的作用。但有研究指出給大鼠杏仁基底外側核注射Ghrelin卻使液體食物的攝入量減少〔9〕，其原因可能是CeA和杏仁基底外側核在攝食調控中起不同的功能，CeA起正調控作用，可增加進食量;杏仁基底外側核則起負調控作用，可減少攝食量。然而，也有研究顯示杏仁核內注射Ghrelin對常規飼料的攝入無明顯影響〔10〕，其原因可能是由于Ghrelin注射進入杏仁核不同的亞核，對攝食產生了或增加或降低的影響，綜合以后可能作用相互抵消，從而導致攝食沒有明顯變化。

弓狀核是下丘腦調節攝食的主要部位，腹腔、腦室及下丘腦外側區注射Ghrelin均能夠使弓狀核內的神經元激活，表明弓狀核在Ghrelin的攝食調控中發揮重要作用。本研究給飽食大鼠CeA內注射Ghrelin導致弓狀核內c-Fos表達也增多，其原因可能是Ghrelin注射入CeA后與該核團內GHS-R結合，導致CeA內相應的神經元激活，從而間接激活了與CeA有纖維聯系的弓狀核。前面提及下丘腦室旁核或外側區注射Ghrelin能夠激活CeA內的神經元〔5，6〕，由此推測在CeA與下丘腦參與攝食調節的一些核團之間可能存在復雜的神經環路，使這些核團相互聯系共同參與Ghrelin對攝食的調節作用，但仍需進一步證實CeA與下丘腦參與攝食調控的核團之間存在Ghrelin能神經纖維投射。大量研究證實禁食使機體內Ghrelin水平顯著提高，從而產生強烈的攝食驅動作用〔11〕。給禁食大鼠腦室注射GHS-R阻斷劑抑制了饑餓大鼠的攝食〔12〕，提示內源性Ghrelin在饑餓引起的攝食中具有重要作用。本研究結果提示內源性Ghrelin在CeA內的信號轉導可能與攝食調控有關，尤其是與能量不足導致的攝食行為有關。

1 Cowley MA，Smith RG，Diano S，et al.The distribution and mechanism of action of ghrelin in the CNS demonstrates a novel hypothalamic circuit regulating energy homeostasis〔J〕.Neuron，2003;37(4):649-61.

2 Zigman JM，Jones JE，Lee CE，et al.Expression of ghrelin receptor mRNA in the rat and the mouse brain〔J〕.Journal of Comparative Neurology，2006;494(3):528-48.

3 Landgren S，Engel JA，Hyytia P，et al.Expression of the gene encoding the ghrelin receptor in rats selected for differential alcohol preference〔J〕.Behav Brain Res，2011;221(1):182-8.

4 Cruz MT，Herman MA，Cote DM，et al.Ghrelin increases GABAergic transmission and interacts with ethanol actions in the rat central nucleus of the amygdala〔J〕.Neuropsychopharmacology，2013;38(2):364-75.

5 Olszewski PK，Li D，Grace MK，et al.Neural basis of orexigenic effects of ghrelin acting within lateral hypothalamus〔J〕.Peptides，2003;24(4):597-602.

6 Olszewski PK，Grace MK，Billington CJ，et al.Hypothalamic paraventricular injections of ghrelin:effect on feeding and c-Fos immunoreac-tivity〔J〕.Peptides，2003;24(6):919-23.

7 Egecioglu E，Jerlhag E，Salome N，et al.Ghrelin increases intake of rewarding food in rodents〔J〕.Addict Biol，2010;15(3):304-11.

8 Skibicka KP，Hansson C，Egecioglu E，et al.Role of ghrelin in food reward:impact of ghrelin on sucrose self-administration and mesolimbic dopamine and acetylcholine receptor gene expression〔J〕.Addict Biol，2012;17(1):95-107.

9 Toth K，Laszlo K，Bagi EE，et al.Effects of intraamygdaloid microinjections of acylated-ghrelin on liquid food intake of rats〔J〕.Brain Res Bull，2008;77(2-3):105-11.

10 Carlini VP，Varas MM，Cragnolini AB，et al.Differential role of the hippocampus，amygdala，and dorsal raphe nucleus in regulating feeding，memory，and anxiety-like behavioral responses to ghrelin〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004;313(3):635-41.

11 Skibicka KP，Dickson SL.Ghrelin and food reward:the story of potential underlying substrates〔J〕.Peptides，2011;32(11):2265-73.

12 Salome N，Haage D，Perrissoud D，et al.Anorexigenic and electrophysiological actions of novel ghrelin receptor(GHS-R1A)antagonists in rats〔J〕.Eur J Pharmacol，2009;612(1-3):167-73.