旋覆花素對阿爾茨海默病模型大鼠腦海馬組織Bax，Bcl-2表達的影響

王英杰 柴錫慶 黃冬霞 李文勝 安小蕾 王書秀 王文勝

(河北醫科大學基礎醫學研究所 省部共建教育部重點實驗室，河北 石家莊 050017)

生理情況下，細胞凋亡參與調節體內正常細胞的更新和異常細胞的清除，對于確保細胞增殖與更新之間的平衡、維持細胞數量的穩定起著重要作用〔1〕。神經細胞凋亡是阿爾茨海默病(AD)等退行性疾病發展過程中的重要事件〔2～4〕，凋亡的神經細胞是不可逆的，但處于凋亡過程中的神經細胞存在不同程度的可逆性。本實驗觀察旋覆花素對Aβ海馬內注射誘導的AD模型大鼠腦海馬組織凋亡相關基因變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只(河北省實驗動物中心提供，動物合格證號:611071)，鼠齡 10～12月齡，體重(364.5±15.0)g，隨機分為對照組、模型組和旋覆花素給藥組，每組10只。給藥組術前 3 d及術后每天用旋覆花素26 mg·kg－1·d－1灌胃，共21 d。模型組用旋覆花素的溶劑吐溫80水溶液同法處理。

1.2 試劑與儀器 旋覆花素由河北醫科大學藥學院從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離制備，含ABL 2.66 g/L。Aβ25～35購自Sigma公司;Bax、Bcl-2抗體購自Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司;腦立體定向儀:江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農機廠制造。

1.3 Aβ25～35的孵育 用無菌生理鹽水將 Aβ25～35稀釋成10 g/L，37 ℃孵育72 h，使其變為聚集狀態的 Aβ25～35，置于在4℃冰箱備用。

1.4 藥物海馬內注射方法 大鼠用質量濃度為20 g/L烏拉坦60 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜〔2〕，以前囟為零點，于前囟后 3.5 mm，中線右側旁開2 mm，為穿刺點，用牙科鉆鉆開顱骨，以微量注射器自腦表面垂直進針3 mm，分別于雙側海馬CA1區于5 min內緩慢注射 Aβ25～35各 1 μl(10 μg)，5 min緩慢注入，留針5 min，對照組注射等量的生理鹽水，退針縫合傷口。術前3 d及術后18 d，給藥組給旋覆花素 26 mg·kg－1·d－1分兩次灌胃，模型組給予等量溶劑。

1.5 免疫組織化學染色 參照使用說明書進行經過乙醇梯度脫水、石蠟垂直包埋，間斷均勻切片，切片厚約 10μm，采用SABC方法進行免疫組化染色。分別以抗Bax(1∶200)、抗 Bcl-2(1∶200)抗體為一抗，其他操作按試劑盒說明書進行。以鏡下出現棕黃色顆粒作為判定陽性染色的標準。用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.6 Western印跡分析 各組取等量蛋白提取液，Bax為80μg，Bcl-2約為80μg，經 12%SDS-PAGE電泳分離后，于半干轉膜儀上轉移至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉封閉，分別與抗Bax抗體(1∶200)、抗 Bcl-2抗體(1∶200)在 4℃條件下反應過夜。然后與HRP標記的相應二抗(1∶10 000)室溫反應2 h，室溫條件下用TTBS、TBS充分震蕩洗膜后采用化學發光法顯影。用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統分析結果。采用美國Kodark公司數碼成像分析軟件對Western印顯色區帶的信號強度進行相對定量分析。

1.7 統計學分析 數據采用SPSS13.0軟件，計量資料以表示，組間資料應用單因素方差分析。

2 結果

2.1 旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織Bax基因表達的影響 模型組大鼠腦海馬組織中Bax表達顯著增強，染色細胞數量多，著色深。應用旋覆花素治療后，染色細胞數量減少，著色變淺(圖1)。模型組大鼠腦海馬組織 Bax表達明顯較對照組高，給予旋覆花素治療后，給藥組大鼠腦海馬組織 Bax表達下降(P＜0.05)。見圖2。

2.2 旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織Bcl-2基因表達的影響 免疫組化染色發現，與對照組海馬組織相比，模型組和旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織的染色無明顯加深，染色細胞數量無明顯增多。Western印跡顯示，對照組大鼠腦海馬組織Bcl-2表達量與模型組及旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織表達量無明顯差別(P＞0.05)，提示旋覆花素對Aβ誘導的AD模型大鼠腦海馬組織的Bcl-2基因的表達影響不大。

3 討論

Bcl-2屬凋亡抑制基因而Bax為凋亡促進基因。NO及其代謝產物NO2、羥基自由基等可導致脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA損害。NO誘導的神經毒性表現在Bcl-2減少、Bax增多以及caspase活化〔5〕。Nie等〔6〕研究發現人參環氧炔醇和人參醇可以抑制NO增高引起的腦皮質神經元的凋亡，其機制可能為促進Bcl-2表達、抑制Bax表達。抗精神失常藥喹硫平可改善APP/PS1雙轉基因鼠的神經損害，抑制β分泌酶(BACE1)表達及活性，減少Aβ沉積，同時Bcl-2表達增加，推測上述改變與Bcl-2的作用有關〔7〕。而體外實驗也證實Aβ42可通過升高Bax/Bcl-2比率引起人神經母細胞瘤細胞死亡〔8〕。Bcl-2和Bax在AD中有著關鍵作用〔9〕。本實驗提示旋覆花素主要通過抑制促凋亡基因Bax的表達，發揮其抑制Aβ海馬內注射誘導AD模型大鼠神經細胞的凋亡。旋覆花素主要通過抑制促凋亡基因Bax的表達，從而抑制Aβ誘導的AD模型大鼠腦海馬的神經細胞凋亡，發揮神經細胞的保護作用，而對凋亡抑制基因Bcl-2表達影響不大。

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8 Clementi ME，Pezzotti M，Orsini F，et al.Alzheimer's amyloid beta-peptide(1-42)induces cell death in human neuroblastoma via Bax/Bcl-2 ratio increase:an intriguing role for methionine 35〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006;342(1):206-13.

9 Perier C，Tieu K，Guégan C，et al.Complex I deficiency primes Bax-dependent neuronal apoptosis through mitochondrial oxidative damage〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(52):19126-31.