蛇毒神經生長因子對大鼠肝星狀細胞增殖、凋亡及肝纖維化相關蛋白質表達的影響

胡仁統，張學榮，徐 瑾，羅小玲，林 興，廖 明

(廣西醫科大學1.醫學科學實驗中心、2.附屬腫瘤醫院，廣西南寧 530021)

多年來對肝纖維化的研究越來越深入，但是缺乏理想的治療方案。目前針對肝纖維化的藥物治療主要還是在離體和動物模型實驗中顯示具有一定的療效，其中包括作用于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和細胞因子的藥物［1］、抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的藥物如干擾素［2］及抗氧化劑［3］等。但讓眾多研究者困惑的是幾乎所有的抗肝纖維化藥物在離體細胞以及動物模型中具有一定的效果而在臨床上無效或效果比較差，這導致了這些抗肝纖維化藥物很難在臨床應用與治療。因為肝纖維化的發生發展是一種多途徑、多因素參與的過程，主要病理改變是ECM的過度合成與異常沉積。HSC是參與肝纖維化的最重要細胞，HSC的活化、增殖被認為是肝纖維化發生的中心環節，而抑制HSC增殖、誘導其凋亡成為抗肝纖維化的重要策略［4］。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)作為神經營養因子的典型代表［5］，其在神經領域的應用已被公認。近年來NGF誘導HSC細胞凋亡的發現為抗肝纖維化藥物的研發提供了一個新的靶點。眼鏡蛇毒中富含NGF，而且分離純化NGF不僅得率較高，還具有耐堿、耐酸、耐蛋白酶水解及穩定性高等的特點，廣西是眼鏡蛇的主要產地，充分開發這一資源具有重要的研究意義。因此，本實驗通過流式細胞術、雙向電泳-質譜技術相結合的方法，在細胞水平探討NGF對HSC-T6細胞增殖、凋亡作用以及細胞中與肝纖維化相關蛋白質的表達差異，為進一步揭示肝纖維化的發展機制及NGF抗肝纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器眼鏡蛇蛇毒NGF由廣西醫科大學蛇毒研究所提供;大鼠肝星狀細胞HSC-T6購于湖南湘雅醫學院;大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC-12)購于上海中科院細胞研究所;胎牛血清、馬血清、F12培養基、MTT購自Sigma公司;高糖DMED培養基購自HYCLONE公司;PC-12細胞用含體積分數為10%胎牛血清+5%馬血清+1%的雙抗的F12K培養液;HSC-T6細胞用含體積分數為10%胎牛血清+1%雙抗的高糖DMED培養液，于CO2培養箱(37℃、5%CO2)培養。雙向電泳所用試劑主要購自Promega公司，17 cm固相pH梯度(IPG)干膠條(pH 3～10)、IPGphorTM等電聚焦系統、Ettan DALT Six垂直電泳儀、高分辨的圖像掃描儀和凝膠斑點采集儀(Picker)購于BIO-RAD公司。所有試劑以去離子水配置。

1.2實驗方法

1.2.1眼鏡蛇毒NGF活性鑒定 將生長良好的PC-12細胞以每毫升5×105個細胞的濃度接種于24孔板。待細胞貼壁后吸掉培養基，加入眼鏡蛇NGF，并換用低濃度血清培養液(體積分數為2%馬血清+5%胎牛血清的F12K培養液)進行培養，使NGF終濃度為2 mg·L－1，培養時間為2～4 d，其間在普通顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.2.2MTT法檢測HSC-T6細胞的增值 取對數生長期的HSC-T6細胞，用含體積分數為10%胎牛血清的高糖DMED培養液調整細胞密度至每毫升2×105個，接種于96孔板。待培養細胞至貼壁后，加入 NGF。以不同濃度 NGF(1、2、5、10、20 mg·L－1)分組，同時設置未加任何藥物的空白對照組，每組設6個復孔。作用24 h后，每孔加5 000 mg·L－1的 MTT 貯存液 20 μl，孵育 4 h，棄上清并每孔再加150 μl DMSO溶解細胞內結晶，振蕩器上振蕩10 min，孵育10 min，酶標儀595 nm處測各孔吸光度。

1.2.3流式細胞儀觀察和測定HSC-T6細胞凋亡實驗設立空白對照組和NGF干預組，NGF濃度根據MTT結果選2、5 mg·L－1的NGF濃度進流式細胞儀實驗。將對數生長的HSC-T6細胞接種于6孔板，每孔2 ml，培養12 h細胞貼壁，吸掉培養基，用體積分數為5%胎牛血清的高糖DMED培養基進行培養，并加入NGF，在培養箱孵育24 h，胰酶消化離心收集細胞。用體積分數為2%BSA的PBS洗細胞兩次，加入300 μl流式上樣緩沖液、5 μl FITC 和 5 μl PI，均勻混合，避光反應5～15 min。0.5 h內上機檢測。

1.2.4雙向凝膠電泳細胞總蛋白的提取 取生長良好的HSC-T6細胞于25 ml培養瓶里進行培養，待細胞長滿培養瓶的60% ～70%開始藥物作用，實驗分為空白對照組和NGF藥物作用組，NGF藥物濃度根據MTT實驗的結果以半數抑制率對應的藥物濃度，用體積分數為5%胎牛血清的高糖DMED培養基培養，藥物作用24 h后分別提取細胞總蛋白，同時每個組做3次平行實驗。提取出來的細胞總蛋白用3 ku的超濾管進行超濾以除鹽，然后用考馬斯亮藍法定量蛋白質濃度，SDS-PAGE電泳分析細胞總蛋白，并把蛋白質等質量分裝真空凍干機凍干備用。

1.2.5雙向凝膠電泳 使用17 cm IPG膠條(非線性)進行等電聚焦電泳，應用膠內泡脹法進行加樣，蛋白上樣量為500 μg左右。采用低電壓50 V，12 h主動水化。等電聚焦步驟如下:500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 5 h，待17 cm膠條等電聚焦總伏時達到60 000 V時結束聚焦。將膠條取出，在平衡液中進行兩步平衡，平衡后將膠條轉移到SDS-PAGE上，用質量分數為0.5%的低熔點瓊脂糖封膠后進行第二向電泳，電泳條件為每塊膠恒定電流10 mA，20 min后將電流加大到30 mA，待溴酚藍指示帶到達凝膠底部處結束電泳。

1.2.6銀染及圖像分析 SDS-PAGE凝膠使用固定液固定2 h以上，敏化液敏化30 min，用蒸餾水漂洗3次，每次15 min，然后銀染20 min，倒掉銀染液用蒸餾水漂洗2次，每次1 min，馬上加入顯色液晃動直到看到明顯的蛋白點，立刻用終止液進行終止反應，最后用蒸餾水保存。然后通過GS-800凝膠掃描儀獲得數字化圖像，并用PD Quest 7.3軟件進行分析。

1.2.7差異蛋白質點的鑒定 對表達差異在2倍以上的蛋白質點從凝膠上用槍頭挖出來，然后進行膠內酶解，把酶解出來的蛋白質多肽用Zip Tip脫鹽柱脫鹽，濃縮后與基質1∶1比例混合，點在點板儀上，自然晾干后MALDI-TOF/TOF-MS檢測，鑒定差異蛋白質。

1.3統計學處理采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，組間差異用t檢驗，以±s表示。圖譜分析由STATA 7.0統計分析軟件(State Corp，College Station，TX，USA)完成。

2 結果

2.1NGF性質鑒定在空白對照組中PC12細胞體積縮小，細胞呈圓形或橢圓形，也有部分呈不規則形，無明顯突起。而NGF實驗組，可見PC12細胞長出多個神經纖維樣的突觸，突觸數目不等，長短不一，有些交織成網狀，細胞的分化程度與NGF呈時間依賴性，見Fig 1。結果表明，NGF能誘導PC12細胞分化，并具有良好的生物學活性。

2.2NGF對HSC-T6細胞增殖的影響將不同濃度的NGF干預對數生長的HSC-T6，MTT結果顯示，與空白對照比較，NGF各劑量組均不同程度地抑制HSC-T6細胞的增殖，NGF濃度為1 mg·L－1時抑制率差異具有統計學意義(P＜0.05);5 mg·L－1差異效果變得比較明顯(P＜0.01)，抑制率先隨著NGF濃度的增加而變大，然后又開始減小，見Tab 1，說明NGF在一定濃度范圍內具有抑制HSC-T6細胞增殖的作用。

Fig 1 Analysis of the activity of PC-12 cells treated with cobra venom NGF

Fig 2 HSC-T6 cells after the cobra venom NGF is added(detected by flow cytometry)

Tab 1 Effect of NGF on the proliferation of HSC-T6(±s)

Tab 1 Effect of NGF on the proliferation of HSC-T6(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·L－1The rata of inhibition/%Control group 0 23.8 ±1.8 NGF 1 25.1 ±2.1*2 38.5 ±2.0＊＊5 48.2 ±1.9＊＊10 67.8 ±2.3＊＊20 56.7 ±2.5＊＊

2.3NGF對HSC-T6細胞凋亡的影響經流式細胞儀檢測顯示，空白對照組有少數細胞凋亡，而NGF干預組作用24 h后檢測不同濃度組均存在不同程度的凋亡。其中NGF濃度為2 mg·L－1時凋亡率(16.16% ±3.02%)，與空白對照組凋亡率(2.70%±1.55%)比較差異具有統計學意義(P＜0.01);當 NGF濃度升到 5 mg·L－1時，凋亡率為21.15%±3.31%，與對照組凋亡率比較差異也具有統計學意義(P＜0.01)，并且凋亡效果更加明顯，說明NGF可誘導HSC-T6細胞發生凋亡，見Fig 2。

2.4細胞總蛋白SDS-PAGE電泳圖SDS-PAGE電泳顯示空白對照組和NGF作用組細胞總蛋白的條帶非常多，分子量大小不一，看不出明顯的差異條帶，見 Fig 3。

2.5HSC-T6細胞的2-DE圖譜的建立及差異分析對空白對照組和NGF作用的實驗組HSC-T6細胞總蛋白進行雙向電泳，獲得2張電泳圖譜，空白對照的HSC-T6細胞和NGF作用的HSC-T6細胞的平均蛋白質點分別為(668±28)個和(607±23)個，兩組之間的匹配率為90.9%。利用圖像分析軟件對蛋白圖譜進行差異分析篩選出差異表達的蛋白47個，其中在NGF作用HSC-T6中表達上調的25個，下調的22個。其中NGF組中箭頭標注為部分差異表達的蛋白質點，見Fig 4。

Fig 3 SDS-PAGE electrophoresis

Fig 4 Two-dimensional electrophoresis

2.6質譜鑒定結果對兩組中表達差異在2倍以上的蛋白質點13個，通過質譜鑒定出13個蛋白質肽譜圖，利用Peptidem查詢軟件搜索Mascot數據庫得到9個蛋白質，有4個無法鑒定出結果。相對于無NGF干預的對照組，在NGF干預的實驗組中有4個表達上調(用“↑”表示)，有5個表達下調(用“↓”表示)，結果見Tab 2，這些蛋白質主要參與細胞增殖、細胞凋亡、細胞代謝以及細胞信號傳導等相關途徑。

3 討論

隨著對肝病研究的不斷深入與發展，肝纖維化被認為是肝硬化、肝癌發生、發展的關鍵而又必經的過程。因此揭示肝纖維化發生發展機制以及抑制其發展成為預防和控制肝癌發展的重要途徑。近來研究表明，逆轉肝纖維化關鍵在于減少活化的HSC數量，而HSC的數量是由HSC增殖和凋亡共同決定的，從理論上講，減少活化HSC數量有這些途徑:抑制HSC的增殖;誘導HSC發生凋亡，直接減少HSC數量;逆轉活化的HSC細胞，讓其變回靜止型等。但研究表明抑制其增殖和誘導凋亡是減少活化型HSC數量的主要途徑［6］。近年來，有研究顯示NGF能抑制HSC細胞增殖并誘導其發生凋亡［7］。

本實驗用眼鏡蛇毒NGF對大鼠肝纖維化細胞株HSC-T6進行干預，MMT檢測結果發現NGF能明顯抑制HSC-T6的增殖(P＜0.05);并且，流式細胞術結果也發現NGF能夠誘導HSC-T6細胞發生凋亡(P＜0.05)，說明NGF具有抑制HSC-T6細胞增殖以及誘導其凋亡的作用。這可能是NGF作用HSCT6細胞后，通過某些途徑參與抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡的過程。有體外實驗證明，NGF誘導HSCT6細胞凋亡主要是通過與細胞表面低親和力受體p75結合介導胞內信號傳遞實現的，而促凋亡受體p75與抗凋亡因子TrkA在細胞凋亡過程中起著主要的作用［8］。

肝纖維化過程中基因并沒有發生改變，而是某些基因表達不足或者過度表達引起，對肝纖維化中那些激活并過度表達的膠原基因進行抑制或封閉，對治療肝纖維化具有廣闊的前景［9］。目前認為ECM是主要的膠原蛋白，其過度表達和異常沉積是肝纖維化發生的主要機制［10］。因此，研究肝纖維化過程中與其相關蛋白質的變化對揭示肝纖維化的發生機制及抗肝纖維化藥物的研發具有主要的意義。雙向電泳(2-DE)作為研究蛋白質組學一種傳統而又實用的技術，其操作簡單，并能夠在一個實驗系統中同時研究多種蛋白質的變化，把這種技術應用于肝纖維化發生發展過程中，有助于全面闡明肝纖維化發生過程中各種蛋白質的變化情況［11］。由于2-DE對蛋白中鹽濃度以及一些雜質比較敏感，容易受到影響，從而使所得的蛋白圖譜分辨率較低。因此，為了得到分辨率更高、重復性更好的細胞蛋白2-DE技術方案，根據多年來在蛋白質組學方面的實驗積累［12～13］，本實驗對樣品預處理方案和硝酸銀染色方法等進行了優化，得到更為理想的細胞2-DE圖譜。

Tab 2 Differentially expressed protein

同時本課題應用雙向電泳-質譜技術相結合，分析眼鏡蛇毒NGF干預前后HSC-T6細胞蛋白質的差異表達，發現在兩張圖譜上相對應的位置并沒有蛋白質點完全沉默，而是相對表達上調或者下調。這也說明在肝纖維化過程中沒有發現基因的異常，而是某些基因過度表達或表達不足。質譜鑒定出的差異的蛋白質，通過功能分析發現這些蛋白主要參與細胞代謝、細胞增殖、細胞凋亡、細胞信號傳導等相關途徑。特別是表達下調的轉化生長因子TGF-β1和金屬蛋白酶組織抑制物TIMP-2，這是與肝纖維化相關性很緊密的蛋白，主要參與調節ECM合成和降解的作用。多項研究表明，TGF-β1是強有力的致纖維化細胞因子，在肝纖維化中表達明顯增多，可促進HSC的增殖和活化，使ECM合成增多，降解減少，并存在正反饋放大效應，促進肝纖維化的進程［14］。而實驗組中發現TGF-β1是表達下調的，這可能是抑制肝纖維化的有利信號。還有些蛋白是酶類，主要參與細胞的代謝與氧化應激反應等過程。說明改變細胞內代謝及氧化應激也可能是引起細胞發生凋亡的一個重要因素。

總之，肝纖維化的發生發展是一個多細胞參與、多途徑的復雜過程，本實驗用眼鏡蛇毒NGF干預HSC-T6細胞，在細胞水平上發現其能抑制HSC-T6細胞的增殖、誘導HSC-T6細胞凋亡以及使HSC-T6細胞中與肝纖維化相關蛋白質表達發生改變，這提示我們蛇毒NGF可能成為一種新型的抗肝纖維化藥物。蛇毒NGF可能是通過上調或者下調與肝纖維化相關蛋白質來實現抑制HSC-T6細胞的增殖、誘導HSC-T6細胞凋亡，從而達到抗肝纖維化的目的。而這些差異蛋白質的結構、功能和在整個抗肝纖維化網絡中的作用有待于進一步的研究。

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