葡萄糖轉運蛋白1在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

葉滿軍，柳宏志，石 晶

（1.大慶油田總醫院 口腔外科，黑龍江 大慶163001；2.佳木斯大學研究生院 口腔臨床醫學系）

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其發病率高，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80%以上。其腫瘤的發生、增殖、分化、轉移都需要大量能量的支持，而葡萄糖是腫瘤的主要能量來源。早在上世紀30年代，Warburg發現腫瘤細胞比正常細胞需要攝取更多的葡萄糖，并且采取糖酵解的方式。葡萄糖轉運蛋白1（GLUT－1）是葡萄糖易化轉運擴散的最主要蛋白之一，負責葡萄糖轉運的基礎糖代謝要求。在許多腫瘤攝取葡萄的過程中，GLUT－1發揮著重要作用。本研究利用免疫組織化學和RT－PCR法檢測口腔鱗癌組織中GLUT－1的蛋白和mRNA的表達情況，探討GLUT－1在口腔鱗癌中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 選取2008年9月至2011年10月大慶油田總醫院口腔頜面外科手術切除并經病理證實的53例OSCC組織和20例正常口腔粘膜組織（距腫瘤邊緣＞3cm），所有口腔癌患者術前均未經化療和放療，所有標本均經石蠟切片病理確診。標本切取后迅速置于液氮或低溫冰箱內冷凍。53例標本中進行如下分類：病理分級：Ⅰ級22例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例；采用國際抗癌協會（UICC）TMN分類標準（2002），臨床TNM 分期：T1～T2期33例，T3～T4期20例；男性44例，女性9例；年齡小于50歲14人，年齡大于50歲39人；有淋巴結轉移19例，無淋巴結轉移34例。

1.1.2 主要試劑 GLUT 1兔抗人多克隆抗體（北京中山生物技術有限公司），免疫組化SP－9001染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），DAB顯色試劑盒 （福州邁新生物試劑公司），過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），OneStep RT－PCR試劑盒購自：德國凱杰生物技術（上海）有限公司，GLUT 1基因和內參照引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫組織化學ABC法 取標本的癌灶、正常組織的石蠟切片4張行蘇木精－伊紅及免疫組織化學染色，免疫組織化學采用SABC法，主要步驟按說明書進行，檸檬酸微波抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染，中性塑膠封片，每組切片均以PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.2 結果判定 結果判定細胞膜連續出現棕黃色為Glut－1的陽性表達，隨機選擇5個高倍鏡視野（＊200），計數1000個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分率，＜10%為（－），＞10%為（＋）。

1.2.3 RT－PCR 用 Trizol提取總 RNA，1%瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳鑒別RNA的完整性，紫外分光光度法檢測RNA的純度及濃度；以β－肌動蛋白為內參，進行逆轉錄和PCR擴增，具體操作按照試劑盒說明進行。GLUT 1引物序列：上游：5′CGGGCCAAGAGTGTACTAAA3′ 下 游： 5′TGACGATACCGGAGCCAATG3′，擴增片段283 bp，β－肌動蛋白引物序列：上游：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′下 游：5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，擴增片段513bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像分析系統觀察并記錄結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件對各組間數據進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化部分

2.1.1 Glut－1蛋白在口腔鱗狀細胞癌和正常口腔黏膜組織中的表達（見表1）Glut－1蛋白在正常粘膜下未見陽性染色，Glut－1均不表達。Glut－1在癌組織中陽性染色位于細胞膜，為棕黃色顆粒，呈灶性或彌散性分布，細胞染色深度不等，遠離血供區癌細胞染色深。53例癌組織和20例正常組織標本中，Glut－1在癌組織和正常組織中表達率分別為62.26%、0%，差異有統計學意義（χ2＝22.726，P＝0.000）。

2.1.2 Glut－1蛋白的表達與臨床病理特征的關系（見表1）Glut－1蛋白在有無淋巴結轉移和不同臨床分型患者間的表達陽性率的差異有統計學意義（P＜0.05）。說明 Glut－1蛋白的表達與淋巴結轉移、臨床分期相關。

Glut－1蛋白在不同組織學類型、不同年齡、不同性別患者間的陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05）。說明Glut－1蛋白的表達與病理分型、年齡、性別無明顯相關性。

2.2 PCR部分

2.2.1 Glut－1mRNA在口腔鱗狀細胞癌和正常口腔黏膜組織中的表達（見圖1、圖2）PCR產物電泳顯示，Glut－1條帶位于283bp處，內參位于513 bp處，與設計完全吻合，癌組織與正常組織相比較，Glut－1的條帶亮度差異十分明顯。53例癌組織和20例正常組織標本中，Glut－1mRNA在癌組織和正常組織中表達率分別為81.13%、5%，差異有統計學意義（χ2＝35.149，P＝0.000）。

圖1 1DNA Marker 2陰性對照3淋巴結轉移陽性（中分化口腔鱗癌）4淋巴結轉移陽性（低分化口腔鱗癌）5淋巴結轉移陰性（高分化口腔鱗癌）6正常口腔黏膜

圖2 1DNA Marker 2正常口腔黏膜3高分化口腔鱗癌4中分化口腔鱗癌5低分化口腔鱗癌6對照

2.2.2 Glut－1mRNA的表達與臨床病理特征的關系（見表1）Glut－1mRNA在不同組織學類型、不同臨床分型、有無淋巴轉移的表達陽性率間的差異有統計學意義（P＜0.05）。說明Glut－1mRNA的表達與病理分型、淋巴結轉移、臨床分期相關。

Glut－1mRNA在不同年齡、不同性別患者陽性表達率間的差異無統計學意義（P＞0.05）。說明Glut－1mRNA的表達與年齡、性別無明顯相關性。

2.3 Glut－1蛋白水平的表達與mRNA水平表達的比較

總體上，mRNA的檢測較免疫組化的蛋白檢測敏感性高，兩種方法的結果與臨床病理的關系基本一致，癌組織陽性表達率高于正常組織，與臨床分期、淋巴結轉移相關，與年齡、性別無關。而在組織學類型方面，免疫組化結果比較無明顯差異，而RTPCR結果差異有統計學意義。

3 討論

研究表明，目前的多克隆抗體免疫組化技術，在人類正常上皮及良性上皮腫瘤組織中未能檢測到Glut－1蛋白的表達，可能因為Glut－1蛋白表達水平較低，而免疫組化方法檢測不夠靈敏，并且Glut－1蛋白易降解。但大量研究表明，Glut－1蛋白在惡性腫瘤中呈普遍高表達陽性率達到或超過50%。Yen等［1］在研究宮頸癌中研究顯示，94%的癌癥患者都有Glut－1過表達，在正常細胞基底層和宮頸上皮良性病變組織中沒有表達或微弱表達；在復發性和持續性腫瘤中，腫瘤大小與Glut－1呈正相關性。楊井等［2］研究顯示Glut－1在惡性黑色素組織中表達明顯上升，且與色素痣比較差異有顯著性意義，提示惡性黑色素瘤的糖的吸收和利用增加，Glut－1有可能作為判斷腫瘤的標記物之一。Kurata等［3］采用定量PCR技術檢測35例原發性肺癌患者病變組織發現，周圍正常肺組織的肝轉移性肺腫瘤和正常肺組織比較顯示，Glut－1mRNA在原發肺腫瘤中的表達顯著高于正常肺組織。對67例軟組織、骨惡性腫瘤患者隨訪，采用 KaPlan－Meier生存分析法顯示，Glut－1在軟組織、骨惡性腫瘤中過度表達，表達程度與腫瘤的轉移、患者的生存率具有相關性［4］。Zhou等［5］檢測了38例頭頸部惡性腫瘤中Glut－1的表達情況，結果顯示Glut－1的基因和蛋白水平均顯著高于癌旁組織和正常組織。

表1 GLUT1蛋白及mRNA在口腔鱗癌中的表達和臨床病理特征的關系

本研究顯示，在正常口腔粘膜組織中Glut－1蛋白不表達，Glut－1mRNA低表達（5%），口腔鱗癌中Glut－1的蛋白和mRNA陽性表達率分別為62.26%和81.13%，，明顯高于正常粘膜組織，且差異均有統計學意義（P＜0.05）.這與 Kunkei等［6］應用免疫組化技術研究118例口腔鱗狀細胞癌發現Glut－1蛋白呈高表達的結果一致。同樣Noguchi等［7］用逆轉錄方法檢測胃癌組織中Glut－1mRNA的表達陽性率為95%，也支持上述結果。提示在口腔鱗癌的發生過程中，Glut－1的過度表達與口腔黏膜上皮細胞的異常增殖相互促進，在口腔鱗癌的發生發展中可能起到重要作用。

Glut－1蛋白和mRNA異常表達與臨床分期、淋巴結轉移均有相關性。此次實驗顯示Glut－1蛋白在有淋巴結轉移的患者和無淋巴結轉移的患者中的陽性表達率分別為54.21%、50.00%，差異有統計學意義（χ2＝6.071，P＝0.014）.Glut－1蛋白在Ⅲ＋Ⅳ期患者和Ⅰ＋Ⅱ期患者中的表達陽性率分別為80.00%、51.52%，差異有統計學意義（χ2＝4.300，P＝0.038）。Glut－1mRNA在有淋巴結轉移的患者和無淋巴結轉移的患者中的陽性表達率分別為100%、70.59%，差 異 有 統 計 學 意 義 （χ2＝6.888，P＝0.009）.Glut－1mRNA 在Ⅲ＋Ⅳ期患者和Ⅰ＋Ⅱ期患者中的表達陽性率分別為95.00%、72.23%，差異有統計學意義（χ2＝4.036，P＝0.045）。Kato等［8］曾用免疫組化研究發現，Glut－1的表達程度與食管癌的腫瘤細胞的浸潤程度、臨床分期、淋巴結轉移有顯著相關性。Jonathan等［9］研究結果同樣顯示Glut－1表達強度越高，患者出現遠處淋巴結轉移率越高，總生存率越低。蔣建國等［10］研究Glut－1蛋白和基因在人喉鱗狀細胞癌中的表達及意義中得出，Glut－1的表達情況與腫瘤的組織學類型、臨床病理分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、預后等病理學特征密切相關。均支持本實驗結果。提示可能III、IV期癌細胞相比較I、II期而言增殖、生長速度更快，能量需求更高，所以Glut－1的表達率更高，同樣，發生淋巴結轉移的癌細胞，對能量的需求高于無淋巴結轉移的癌細胞。說明Glut－1的表達與腫瘤細胞的侵襲性密切相關，且隨著Glut－1的表達增加癌細胞的生物學行為更差，預后不良。

Glut－1蛋白和Glut－1mRNA的異常表達與癌組織分化程度的關聯性存在差異，本實驗顯示口腔鱗癌組織中Glut－1蛋白的表達在高分化中為54.55%、中分化為55.56%、低分化為84.62%，差異均無統計學意義（P＞0.05）。口腔鱗癌組織中Glut－1mRNA的表達在高分化中為63.44%、中分化為88.89%、低分化為100%，差異有統計學意義（P＜0.05）。這可能與免疫組化自身不可避免的誤差，存在假陽性和假陰性的可能，而RT－PCR實驗過程中同樣存在假基因干擾、外源基因污染、RNA的非法轉錄等客觀因素，影響實驗的準確性。目前研究結果顯示Glut－1異常表達與組織學的關系尚無定論。例如Aiopi等［11］發現乳腺癌組織中Glut－1陽性率呈高表達，表達強度與與病理分級正相關。Km等［12］在研究直腸癌組織中發現Glut－1的表達與病理分級呈正相關性，高核分裂像組織中Glut－1表達強度明顯高于低分裂像組織。張鵬飛等［13］在研究胃癌中Glut－1的表達時同樣認為Glut－1的表達同病理分級呈正相關性。但也有不同意見，鄒積艷等［14］在研究卵巢癌中Glut－1表示是發現Glut－1的高表達與組織學分級無相關性。裘正軍等［15］在研究胰腺癌、許樂等［16］在研究腎癌組織中的Glut－1表達均得出同樣結論。Glut－1的表達與組織分型的關系在不同腫瘤中表現出的差異性，可能是由于在不同性質中的腫瘤中Glut－1的調控機制并不完全相同。Glut－1在腫瘤細胞的表達與多種因素有關，受內在和外在的信號調控，并且一種腫瘤可以表達一種或幾種Glut，在腫瘤的能量代謝方面發揮不同的作用。因此，Glut－1在不同腫瘤中的表達機制還有待進一步研究。

Glut－1在大多數惡性腫瘤中高表達對腫瘤的診斷和治療具有重要意義。通過檢測Glut－1在腫瘤中的表達，可以為腫瘤的早期判斷提供有效地幫助。目前以Glut－1為靶點降低葡萄糖的攝取，從而阻斷腫瘤的能量供應來治療腫瘤的方法已經悄然興起。目前仍需進一步研究Glut－1在各種不同組織中各自表達和調節作用、以及Glut－1在不同組織中的運輸過程，這將為惡性腫瘤的診斷、預后、治療提供可靠的理論依據。

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