高效液相色譜手性流動相添加法分離氟比洛芬對映體及其分離機制

沈芒芒 鄭 燁 顏繼忠 童勝強

（浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310032）

環糊精作為高效液相色譜 (HPLC)流動相手性拆分劑廣泛用于手性藥物的拆分。大多數環糊精及其衍生物作為手性流動相添加劑的研究表明[1]，環糊精與溶質形成的包結配合物與固定相的相互作用減弱，保留時間縮短，分離選擇性提高，可通過包結常數解釋配合物在反相液相色譜中的保留行為，這對拆分手性化合物具有重要的意義。

氟比洛芬 (Flurbiprofen)是一種新型非甾體抗炎鎮痛藥，其化學名為2-(2-氟-4-聯苯基)丙酸[2-(2-fluorobiphenyl-4-yl)propanoic acid]，臨床上主要用于治療風濕性關節炎、骨關節炎和外傷疼痛等。氟比洛芬分子中α位為手性碳原子，存在1對光學對映異構體（其結構見圖1）。研究發現抗炎成分主要存在于S型異構體中，新的研究證明R型異構體可防治阿爾茨海默病[2]。因此，對氟比洛芬對映體進行拆分具有重要意義。已經有用熒光光譜法研究β-環糊精衍生物對氟比洛芬的包結作用[3]。Ye Jincui等采用高效液相色譜手性流動相法成功拆分了8種2-芳基丙酸類藥物[4]。本文以羥丙基-β-環糊精為手性流動相添加劑，采用C18反相色譜柱,探討了羥丙基-β-環糊精與氟比洛芬的包結方式,建立氟比洛芬對映體的高效液相色譜拆分法,同時考察了羥丙基-β-環糊精的濃度、流動相pH、有機調節劑和柱溫等因素對手性拆分的影響。

Fig.1 The structure of Flurbiprofen(圖1 氟比洛芬結構式)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Water1525系列高效液相色譜儀，配Water1525雙泵，Water2487二極管陣列檢測器，Water717plus自動進樣器，Water Breeze色譜工作站；Mettler-Toledo酸度計。

氟比洛芬對映體購于北京百靈威化學技術有限公司，含量大于99%；羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)購于山東新大精細化工有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱YMC-Pack ODS-A C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為pH=3.5的0.5%乙酸三乙胺緩沖溶液 （含25 mmol/L羥丙基-β-環糊精）:甲醇=80:20(V/V)；流速為1.0 ml/min；柱溫為37℃；檢測波長為247 nm；進樣量為5 μL。

1.3 實驗方法

精密稱取12.5 mg的氟比洛芬對映體于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度線，制成0.5 mg/mL標準溶液，于4℃冰箱中冷藏保存。臨用時取上述標準溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即可在色譜條件下進行拆分。

2 結果與討論

2.1 保留機制

Armstrong等[5]報道了在液相色譜中，以環糊精衍生物作為手性流動相添加劑時，環糊精衍生物與對映體可能存在1:1或1:2的包結關系，當被拆分的溶質與環糊精只形成包結比為1:1的配合物而不形成1:2的配合物時，拆分過程中可能存在以下平衡：

其中F為被分離的自由溶質氟比洛芬，A是液相色譜柱固定相的吸附點，CD是羥丙基-β-環糊精分子，FCD是氟比洛芬與環糊精形成的1:1包結物，k為氟比洛芬與色譜柱固定相吸附點的吸附平衡常數，k1為氟比洛芬與環糊精形成1:1包結物的包結常數。被分離的溶質總量Ftot(mol)為：

由色譜容量因子(k'=(tR-t0)/t0)的定義[6]可知：

其中φ為相比率

通過上述(1)-(4)，可以得出

當環糊精與溶質以1:1結合時，經推導得出容量因子與環糊精濃度的關系式如下：

由(6)可得。將1/k'對環糊精濃度[CD]作圖，若圖為直線即符合上述式子，則可以說明氟比洛芬與環糊精形成1:1的包結物，并可以通過直線的斜率和截距求得相應的k1，即為包結常數。

2.2 不同色譜條件對手性分離的影響

2.2.1 HP-β-CD濃度對手性分離的影響

HP-β-CD作為手性拆分劑，其濃度對分離產生重要影響，具體見表1。實驗表明，隨著HP-β-CD濃度的增加，容量因子顯著降低，這一變化趨勢與式(6)一致。根據表1的數據分別以兩對映體的1/k'對HP-β-CD濃度作圖(圖2)，得到線性回歸方程分別為:

從圖中看出兩曲線都呈現良好的線性關系，符合式(6)的假設，說明氟比洛芬與HP-β-CD形成1:1包結物，且通過截距和斜率得出包結物的兩對映體與HP-β-CD形成過程中的包結常數，其中 (+)-氟比洛芬的包結常數為1.83 L/mol，(-)-氟比洛芬的包結常數為1.67 L/mol。

實驗過程中，在一定HP-β-CD濃度范圍內，增加HP-β-CD的濃度，對映體的保留時間會縮短，但濃度過高會導致柱壓過大，影響色譜柱的使用壽命，綜合考慮各個因素，本文選用HP-β-CD的濃度為25 mmol/L。

表1 HP-β-CD濃度對容量因子及分離度RS的影響Table1 The effect of the concentration of HP-β-CD on the capacity factor and resolution of flurbiprofen

Fig2 The reciprocal value for experimental capacity factor plotted against the HP-β-CD concentration(圖2 對映體容量因子的倒數值1/k'與手性拆分劑HP-β-CD濃度的線性關系)

2.2.2 流動相pH對手性分離的影響

在手性拆分中，pH對拆分效果影響較大。實驗中同時考察了磷酸緩沖溶液和乙酸三乙胺緩沖溶液，用磷酸緩沖溶液柱壓會高于乙酸三乙胺緩沖溶液，故本文采用乙酸三乙胺緩沖液進行不同pH值的考察。在其他條件相同時，氟比洛芬對映體在pH值3.0～4.6之間可以達到較好的分離，其結果見表2。這可能是因為氟比洛芬是一類有機酸，pH值較低時，藥物處于分子狀態，隨著pH值增加，其電離程度增加，在反相柱上的保留時間縮短。綜合考慮各個因素，本文選用pH值為3.5。

表2 流動相pH值對分離度的影響Table2 the effect of pH value of mobile phase on the resolution of flurbiprofen

2.2.3 有機調節劑對手性分離的影響

用HP-β-CD為流動相添加劑分離手性藥物時，需要加入有機極性調節劑以降低其在固定相中的吸附，增大了對映體與環糊精的相互作用差異，從而達到分離目的。在實驗中嘗試了甲醇、乙腈等作為有機極性調節劑，在相同條件下，僅用乙腈不能分離氟比洛芬，而用甲醇可以達到較好的分離，且隨著甲醇比例的增大，保留時間減少，但分離度也減少。同時在實驗中嘗試了甲醇和乙腈混合作為極性調節劑，隨著乙腈濃度的增加，保留時間增加，分離效果增加不明顯。故本文優選采用流動相中的純甲醇比例為20%作為有機調節劑。

2.2.4 柱溫對手性分離的影響

柱溫對手性分離有一定的影響。在本文研究中發現，隨著溫度的升高，氟比洛芬對映體的保留時間縮短，但是分離度逐漸降低。為了達到好的分離效果，實驗中采用的柱溫為30℃。

在最佳色譜條件下，分離氟比洛芬對映體，分離結果見圖3。

Fig.3 HPLC Chromatogram of Flurbiprofen Enantiomers(圖3 氟比洛芬對映體拆分的高效液相色譜圖)

3 結論

采用反相高效液相色譜手性流動相添加法建立了氟比洛芬對映體的手性分析方法，表明HP-β-CD與氟比洛芬對映體是以1:1的方式包結方式結合，同時考察了羥丙基-β-環糊精的濃度、流動相pH值、有機調節劑、柱溫等對拆分效果的影響，確定了最優的手性分離條件。最終色譜條件為：YMC-Pack ODS-A C18(150 mm ×4.6 mm,5 μm)色譜柱，流動相為0.5%乙酸(pH3.5,三乙胺調節)含25 mmol/L羥丙基-β-環糊精:甲醇 (80:20,V/V)，流速為 1.0 mL/min,柱溫為30℃，紫外檢測波長為247 nm。

[1]胡育筑,陳玉英,陳德英.HP-β-環糊精對鹽酸舍曲林異構體手性選擇包合和色譜保留行為影響的研究[J].2004,34(1):239-245.

[2]邢志華,野津,王金宏,等.HPLC法拆分氟比洛芬.黑龍江醫藥,2012,25(2):198-200.

[3]苗家兵,周濤,唐課文,等.熒光光譜法研究β-環糊精衍生物對氟比洛芬的包結作用.光譜實驗室,2010,27(4):1532-1536.

[4]Ye J C,Yu W Y,Chen G S,et al.Enantiomeric separation of 2-arylpropionic acid nonsteroidal anti-inflammatory drugs by HPLC with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as chiralmobile phase additive [J].Biomed.Chromatogr.,2010,24:799-807.

[5]Armstrong D W,Nome F,Spino L A.Efficient detection and evaluation of cyclodextrin multiple complex formations[J].Am.Chem.Soc.,1986,108(7):1418-1421.

[6]陳立仁.液相色譜手性分離[M].北京:科學出版社,2006:134.