藥物在體內分布及肝靶向性研究

郭影坤， 隋 陽

（ 東北制藥集團供銷有限公司， 遼寧 沈陽 110023）

齊墩果酸（OA）分子式為 C30H48O3，臨床用于治療慢性病毒性肝炎，對癥狀、體征和肝功能均有明顯的改善作用[1]，還能明顯降低高齡鼠腦、肝中的過氧化脂質含量，提高肝中超氧化物歧化酶（SOD）活性，具有抗衰老的作用[2]。納米粒（NPs）是一種毒性小、穩定性好的靶向制劑，經靜脈注射入血后能夠將包裹的藥物濃集于肝、脾，降低了藥物在其他組織中的分布。聚乙二醇1 000維生素E琥珀酸酯（TPGS）是維生素E的水溶性衍生物，廣泛應用于制劑研究中，作為增溶劑、吸收促進劑、乳化劑、增塑劑以及脂溶性藥物傳遞系統的載體，同時具有肝細胞特異性識別的作用[3]。乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種生物可降解性合成高分子材料[4]，而本試驗采用的是將TPGS和PLGA合成的新型載體材料—乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素 E（PLGA-TPGS），不但可通過控制納米粒的大小，實現齊墩果酸對肝臟的被動靶向作用，同時由于TPGS具有肝細胞特異性識別的作用，可使納米粒又具有對肝臟的主動靶向作用，可增強齊墩果酸在靶位的活性、作用時間，減少給藥量以及在非靶部位的聚集和毒副作用，使齊墩果酸能更好的發揮作用。

1 實驗部分

1.1 藥品和試劑

齊墩果酸對照品、齊墩果酸、水溶性維生素E、乳酸羥基乙酸共聚物、乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E、冰醋酸、甲醇、甲基叔丁基醚、實驗用水均為去離子雙蒸水。

1.2 儀器

1100型高效液相色譜儀、FA1104I上皿電子天平、BF-2000 氮氣吹干儀、XW-80A漩渦混合器、TGL-16C高速臺式離心機、IKAT-10組織分散機。

2 方法和結果

2.1 RP-HPLC條件和行為

色譜柱為 HYPERSIL C18；流動相為甲醇:0.03%醋酸溶液（90:10）；流速為1.0 mL?min-1；檢測波長為210 nm[7]，柱溫為20 ℃，進樣量為10 μL。齊墩果酸（OA）色譜峰與其他組分峰能達到基線分離，OA的保留時間約12.7 min，理論板數按齊墩果酸峰計算不低于4 000。

2.2 齊墩果酸納米粒的制備工藝

取齊墩果酸樣品30 mg置10 mL離心管中，再乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素 E100 mg置離心管中，加入8 mL乙酸乙酯，量取0.03%TPGS水溶液 120 mL置 250 mL燒杯中，加入 OA和PLGA-TPGS的乙酸乙酯溶液，超聲 12 min，525 r?min-1電動攪拌 12 h，16 000 r?min-1高速離心 15 min，洗3次，冷凍干燥24 h，得OA -NPs。

2.3 RP-HPLC法測定

2.3.1 OA對照品溶液的配制

稱取OA對照品50.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇制濃度為 500 μg?mL-1的對照品貯備液。分別精密量取OA對照品貯備液配成6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg?mL-1系列濃度對照貯備液。

2.3.2 生物樣品的預處理

小鼠從眼靜脈叢取血，處死后取出肝、心、脾、肺、腎等臟器，加2倍量生理鹽水制成勻漿。分別取血清和各臟器勻漿0.1 mL，用甲基叔丁基醚提取取有機層用氮氣流吹干，最后加入 100 μL甲醇漩渦，取20 μL進樣。

2.3.3 標準曲線的繪制

分別取空白血清和各臟器勻漿0.1 mL，加入0.1 mL不同濃度的OA對照貯備液，再加入甲基叔丁基醚1.0 mL，提取兩次[5]，取有機層氮氣流吹干，最后加入100 μL甲醇振蕩溶解，取20 μL進樣，HPLC法測定。以OA峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸，得血清和各臟器勻漿的標準曲線，分別為：血清：A=2950.3C–1967.6，r=0.9989；心勻漿：A=3693.5C+27372，r=0.9912；肝勻漿：A=3693.5C+27372，r=0.9901；脾勻漿：A=5365.5C–29533， r=0.9962； 肺 勻 漿 ：A=10227C-42762，r=0.9784；腎勻漿：A=4661C–35401，r=0.9910。結果表明，OA 在 6.25～100.0 μg?mL-1范圍內線性關系良好， OA最低檢測濃度為 1 μg?mL-1。

2.3.4 加樣回收試驗

分別取空白血清或臟器勻漿0.1 mL，分別精密加入6.25、25、100 μg?mL-1的OA對照品溶液0.1 mL，配制成低、中、高3個濃度測定血清及各組織樣品中OA的回收率，測定峰面積（A），各樣品平行操作6份。根據標準曲線計算含量，以測得量與加入量比較，計算血清和各臟器的回收率見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Table 1 Recovery test results（n=6）

表明此法用于測定樣品含量的準確度好。

2.3.5 精密度試驗

取空白血清和臟器勻漿0.1 mL，分別加入12.5、25、100 μg?mL-1的 OA 對照品溶液 0.1 mL，每天在同一時間進樣連續測定5 d，分別測定OA對照貯備液的日內精密度和日間精密度見表2。

表2 精密度試驗結果（n=6）Table 2 The results of precision test（n=6）

結果RSD值均＜3%，表明取樣精密度良好。

2.4 OA-NPs在小鼠體內的分布和肝靶向性測定

2.4.1 小鼠給藥方案

取小鼠120只，隨機分為12組，每組10只。其中6組OA-NPs組，6組為OA-SOLs組。禁食12 h后按20 mg?kg-1劑量尾靜脈注射給藥。分別于藥后的5、30、60、120、240、480 min處理一組。

2.4.2 OA在血清和各臟器中的濃度值

OA-NPs經小鼠尾靜脈注射后各時間點血和各器官中藥物濃度值見表3和圖1；OA-SOLs經小鼠尾靜脈注射后各時間點血和各器官中藥物濃度值見表4和圖2；OA-NPs和OA-SOLs在肝中60 min時的藥物濃度比較見圖3。

表3 OA-NPs小鼠尾靜脈注射后各時間點血清和各器官中藥物濃度(n=10)Table 3 Drug concentration(n=10)in serum and various organs at different time points after OA-NPs mouse tail vein injection μg?mL-1

圖1 OA-NPs靜脈注射后血清和各器官中藥物濃度-時間曲線圖Fig.1 The curve of drug concentration and time in serum and various organs after OA-NPs intravenous injection

圖2 OA-SOLs靜脈注射后血清和各器官中藥物濃度-時間曲線圖Fig. 2 The curve of drug concentration and time in serum and various organs after OA-SOLs intravenous injection

表4 OA-SOLs小鼠尾靜脈注射后各時間點血清和各器官中藥物濃度(μg?mL-1，n=10)Table 4 Drug concentrations in serum and various organs at different time points after OA-SOLs mouse tail vein injection(μg?mL-1 ，n=10)

2.4.3 OA-NPs靶向指數和選擇性指數

靶向指數（TI）是指給予實驗動物載藥納米粒和游離藥物后，靶器官（肝臟）藥物濃度之比；選擇性指數（SI）是指給予實驗動物載藥納米粒后，靶器官（肝臟）藥物濃度與血清中藥物濃度之比。根據表3和表4可得出各時間點載藥納米粒和游離藥物在肝臟的TI和SI值，結果見表5。

表5 OA-NPs尾靜脈注射后各時間點的TI和SI值Table 5 TI and SI values at different time points after OA-NPs tail vein injection

OA-NPs經尾靜脈注射后均具有較好的肝靶向性。

圖3 OA-NPs 和OA-SOLs靜脈注射60 min后血清和各器官中藥物濃度圖Fig.3 Drug concentration diagram in serum and various organs at 60 min after OA-NPs and OA-SOLs intravenous injection

2.4.4 相對靶向效率

相對靶向效率（Re）是指給予實驗動物載藥納米粒和游離藥物后，各器官AUC之比,即Re =AUC OA-NPs /AUC OA-SOLs。OA-NPs和 OA-SOLs經尾靜脈注射后各組織AUC和Re值見表6。

表6 OA在血清和各器官的AUCTable 6 AUC of OA in the serum and various organs

結果肝臟的Re值最大，表明OA-NPs具有較大的肝靶向性。

2.4.5 靶向效率

靶向效率（Te）是指給予實驗動物載藥納米粒和游離藥物后，靶器官與各非靶器官的AUC之比，即 Te=AUC靶器官/AUC非靶器官。OA-NPs和OA-SOLs尾靜脈注射后肝靶向的Te值見表7。

表7 OA-NPs和OA-SOLs小鼠尾靜脈注射后的Te值Table 7 Te value after OA-NPs and OA-SOLs mice intravenous injection

結果表明，OA-NPs具有很好的肝臟靶向作用。

3 討 論

(1)本實驗制備的OA-NPs屬于主動靶向制劑，不但可通過控制納米粒的粒徑大小，實現齊墩果酸對肝臟的被動靶向作用，同時由于TPGS具有肝細胞特異性識別的作用，可使納米粒又具有對肝臟的主動靶向作用，不但可增強齊墩果酸在靶位的活性、作用時間，還可減少給藥量以及在非靶部位的聚集和毒副作用，使齊墩果酸能更好的發揮其作用。

(2)本實驗制備的OA-NPs使OA在肝臟和血清中維持時間明顯延長，在肝臟中的濃集作用明顯加強，這是OA-NPs的緩釋效應和肝靶向性所致。由圖8和9可見，在血清中OA-NPs組的OA可維持到240 min，而OA-SOLs組僅能維持到60 min；在肝臟中OA-NPs組可維持到480 min，而OA-SOLs組也只能維持到120 min。

(3)本研究選用 4個靶向性評價指標評價OA-NPs對主要器官的靶向性，即TI、SI、Te和Re。TI和SI全面反映了各時間OA-NPs對主要器官的靶向性，但并未代表OA-NPs在整個觀察時間段內對肝臟的靶性，即沒有反映藥物在體內作用的全過程。Te和Re以AUC作為比較單位，可以反映藥物在整個觀察時間段內的靶向性，能充分反映藥物在體內的吸收、分布、消除等全過程。以上指標綜合考察，全面客觀地反映了OA-NPs對肝臟的靶向性。

(4)不少藥物體內靶向分布研究采用同位素測定技術，原因在于該技術靈敏度高，生物樣品處理簡單，測定速度快，可進行大批量同時測定等優點。但也存在測定結果重現性差、代謝物干擾、放射性污染及同位素效應等問題。本試驗采用 RP-HPLC法測定，建立的方法樣品前處理簡單，在所選條件下，內源性物質與OA能得到很好的分離，測定結果準確，重現性好，同時避免了由于放射性同位素的引入所導致的與原藥不同的體內分布。

4 結 論

建立了測定生物樣品中 OA濃度的 RP-HPLC法。進行了OA-NPs、OA-SOLs在小鼠體內的分布及靶向性研究。結果表明，OA-NPs對肝臟有良好的靶向性作用，其結果客觀可靠。

［1］國家醫藥管理局中草藥中心情報站.植物有效成分手冊[M].北京:人民衛生社,1986:786-787.

［2］王立新,韓廣軒,劉文庸,等.齊墩果酸的化學及藥理研究[J].天然藥物,2001,19(2):104-107.

［3］顧惕人.表面化學[M].北京:科學出版社,1999:58-92.

［4］樊新,陳劍,阮建明,等.聚乳酸類可降解材料研究進展[J].粉末冶金材料科學與工程,2008,13(4):187-194.

［5］王婧雯. 齊墩果酸固體脂質納米粒肝靶向性及藥效學研究[D].西安:第四軍醫大學學位論文,2007:40-46.