藥物在體內(nèi)分布及肝靶向性研究

郭影坤， 隋 陽

（ 東北制藥集團供銷有限公司， 遼寧 沈陽 110023）

齊墩果酸（OA）分子式為 C30H48O3，臨床用于治療慢性病毒性肝炎，對癥狀、體征和肝功能均有明顯的改善作用[1]，還能明顯降低高齡鼠腦、肝中的過氧化脂質(zhì)含量，提高肝中超氧化物歧化酶（SOD）活性，具有抗衰老的作用[2]。納米粒（NPs）是一種毒性小、穩(wěn)定性好的靶向制劑，經(jīng)靜脈注射入血后能夠?qū)乃幬餄饧诟巍⑵ⅲ档土怂幬镌谄渌M織中的分布。聚乙二醇1 000維生素E琥珀酸酯（TPGS）是維生素E的水溶性衍生物，廣泛應(yīng)用于制劑研究中，作為增溶劑、吸收促進劑、乳化劑、增塑劑以及脂溶性藥物傳遞系統(tǒng)的載體，同時具有肝細胞特異性識別的作用[3]。乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）是一種生物可降解性合成高分子材料[4]，而本試驗采用的是將TPGS和PLGA合成的新型載體材料—乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素 E（PLGA-TPGS），不但可通過控制納米粒的大小，實現(xiàn)齊墩果酸對肝臟的被動靶向作用，同時由于TPGS具有肝細胞特異性識別的作用，可使納米粒又具有對肝臟的主動靶向作用，可增強齊墩果酸在靶位的活性、作用時間，減少給藥量以及在非靶部位的聚集和毒副作用，使齊墩果酸能更好的發(fā)揮作用。

1 實驗部分

1.1 藥品和試劑

齊墩果酸對照品、齊墩果酸、水溶性維生素E、乳酸羥基乙酸共聚物、乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E、冰醋酸、甲醇、甲基叔丁基醚、實驗用水均為去離子雙蒸水。

1.2 儀器

1100型高效液相色譜儀、FA1104I上皿電子天平、BF-2000 氮氣吹干儀、XW-80A漩渦混合器、TGL-16C高速臺式離心機、IKAT-10組織分散機。

2 方法和結(jié)果

2.1 RP-HPLC條件和行為

色譜柱為 HYPERSIL C18；流動相為甲醇:0.03%醋酸溶液（90:10）；流速為1.0 mL?min-1；檢測波長為210 nm[7]，柱溫為20 ℃，進樣量為10 μL。齊墩果酸（OA）色譜峰與其他組分峰能達到基線分離，OA的保留時間約12.7 min，理論板數(shù)按齊墩果酸峰計算不低于4 000。

2.2 齊墩果酸納米粒的制備工藝

取齊墩果酸樣品30 mg置10 mL離心管中，再乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素 E100 mg置離心管中，加入8 mL乙酸乙酯，量取0.03%TPGS水溶液 120 mL置 250 mL燒杯中，加入 OA和PLGA-TPGS的乙酸乙酯溶液，超聲 12 min，525 r?min-1電動攪拌 12 h，16 000 r?min-1高速離心 15 min，洗3次，冷凍干燥24 h，得OA -NPs。

2.3 RP-HPLC法測定

2.3.1 OA對照品溶液的配制

稱取OA對照品50.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇制濃度為 500 μg?mL-1的對照品貯備液。分別精密量取OA對照品貯備液配成6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg?mL-1系列濃度對照貯備液。

2.3.2 生物樣品的預(yù)處理

小鼠從眼靜脈叢取血，處死后取出肝、心、脾、肺、腎等臟器，加2倍量生理鹽水制成勻漿。分別取血清和各臟器勻漿0.1 mL，用甲基叔丁基醚提取取有機層用氮氣流吹干，最后加入 100 μL甲醇漩渦，取20 μL進樣。

2.3.3 標準曲線的繪制

分別取空白血清和各臟器勻漿0.1 mL，加入0.1 mL不同濃度的OA對照貯備液，再加入甲基叔丁基醚1.0 mL，提取兩次[5]，取有機層氮氣流吹干，最后加入100 μL甲醇振蕩溶解，取20 μL進樣，HPLC法測定。以O(shè)A峰面積（A）對濃度（C）進行線性回歸，得血清和各臟器勻漿的標準曲線，分別為：血清：A=2950.3C–1967.6，r=0.9989；心勻漿：A=3693.5C+27372，r=0.9912；肝勻漿：A=3693.5C+27372，r=0.9901；脾勻漿：A=5365.5C–29533， r=0.9962； 肺 勻 漿 ：A=10227C-42762，r=0.9784；腎勻漿：A=4661C–35401，r=0.9910。結(jié)果表明，OA 在 6.25～100.0 μg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， OA最低檢測濃度為 1 μg?mL-1。

2.3.4 加樣回收試驗

分別取空白血清或臟器勻漿0.1 mL，分別精密加入6.25、25、100 μg?mL-1的OA對照品溶液0.1 mL，配制成低、中、高3個濃度測定血清及各組織樣品中OA的回收率，測定峰面積（A），各樣品平行操作6份。根據(jù)標準曲線計算含量，以測得量與加入量比較，計算血清和各臟器的回收率見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Table 1 Recovery test results（n=6）

表明此法用于測定樣品含量的準確度好。

2.3.5 精密度試驗

取空白血清和臟器勻漿0.1 mL，分別加入12.5、25、100 μg?mL-1的 OA 對照品溶液 0.1 mL，每天在同一時間進樣連續(xù)測定5 d，分別測定OA對照貯備液的日內(nèi)精密度和日間精密度見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 2 The results of precision test（n=6）

結(jié)果RSD值均＜3%，表明取樣精密度良好。

2.4 OA-NPs在小鼠體內(nèi)的分布和肝靶向性測定

2.4.1 小鼠給藥方案

取小鼠120只，隨機分為12組，每組10只。其中6組OA-NPs組，6組為OA-SOLs組。禁食12 h后按20 mg?kg-1劑量尾靜脈注射給藥。分別于藥后的5、30、60、120、240、480 min處理一組。

2.4.2 OA在血清和各臟器中的濃度值

OA-NPs經(jīng)小鼠尾靜脈注射后各時間點血和各器官中藥物濃度值見表3和圖1；OA-SOLs經(jīng)小鼠尾靜脈注射后各時間點血和各器官中藥物濃度值見表4和圖2；OA-NPs和OA-SOLs在肝中60 min時的藥物濃度比較見圖3。

表3 OA-NPs小鼠尾靜脈注射后各時間點血清和各器官中藥物濃度(n=10)Table 3 Drug concentration(n=10)in serum and various organs at different time points after OA-NPs mouse tail vein injection μg?mL-1

圖1 OA-NPs靜脈注射后血清和各器官中藥物濃度-時間曲線圖Fig.1 The curve of drug concentration and time in serum and various organs after OA-NPs intravenous injection

圖2 OA-SOLs靜脈注射后血清和各器官中藥物濃度-時間曲線圖Fig. 2 The curve of drug concentration and time in serum and various organs after OA-SOLs intravenous injection

表4 OA-SOLs小鼠尾靜脈注射后各時間點血清和各器官中藥物濃度(μg?mL-1，n=10)Table 4 Drug concentrations in serum and various organs at different time points after OA-SOLs mouse tail vein injection(μg?mL-1 ，n=10)

2.4.3 OA-NPs靶向指數(shù)和選擇性指數(shù)

靶向指數(shù)（TI）是指給予實驗動物載藥納米粒和游離藥物后，靶器官（肝臟）藥物濃度之比；選擇性指數(shù)（SI）是指給予實驗動物載藥納米粒后，靶器官（肝臟）藥物濃度與血清中藥物濃度之比。根據(jù)表3和表4可得出各時間點載藥納米粒和游離藥物在肝臟的TI和SI值，結(jié)果見表5。

表5 OA-NPs尾靜脈注射后各時間點的TI和SI值Table 5 TI and SI values at different time points after OA-NPs tail vein injection

OA-NPs經(jīng)尾靜脈注射后均具有較好的肝靶向性。

圖3 OA-NPs 和OA-SOLs靜脈注射60 min后血清和各器官中藥物濃度圖Fig.3 Drug concentration diagram in serum and various organs at 60 min after OA-NPs and OA-SOLs intravenous injection

2.4.4 相對靶向效率

相對靶向效率（Re）是指給予實驗動物載藥納米粒和游離藥物后，各器官AUC之比,即Re =AUC OA-NPs /AUC OA-SOLs。OA-NPs和 OA-SOLs經(jīng)尾靜脈注射后各組織AUC和Re值見表6。

表6 OA在血清和各器官的AUCTable 6 AUC of OA in the serum and various organs

結(jié)果肝臟的Re值最大，表明OA-NPs具有較大的肝靶向性。

2.4.5 靶向效率

靶向效率（Te）是指給予實驗動物載藥納米粒和游離藥物后，靶器官與各非靶器官的AUC之比，即 Te=AUC靶器官/AUC非靶器官。OA-NPs和OA-SOLs尾靜脈注射后肝靶向的Te值見表7。

表7 OA-NPs和OA-SOLs小鼠尾靜脈注射后的Te值Table 7 Te value after OA-NPs and OA-SOLs mice intravenous injection

結(jié)果表明，OA-NPs具有很好的肝臟靶向作用。

3 討 論

(1)本實驗制備的OA-NPs屬于主動靶向制劑，不但可通過控制納米粒的粒徑大小，實現(xiàn)齊墩果酸對肝臟的被動靶向作用，同時由于TPGS具有肝細胞特異性識別的作用，可使納米粒又具有對肝臟的主動靶向作用，不但可增強齊墩果酸在靶位的活性、作用時間，還可減少給藥量以及在非靶部位的聚集和毒副作用，使齊墩果酸能更好的發(fā)揮其作用。

(2)本實驗制備的OA-NPs使OA在肝臟和血清中維持時間明顯延長，在肝臟中的濃集作用明顯加強，這是OA-NPs的緩釋效應(yīng)和肝靶向性所致。由圖8和9可見，在血清中OA-NPs組的OA可維持到240 min，而OA-SOLs組僅能維持到60 min；在肝臟中OA-NPs組可維持到480 min，而OA-SOLs組也只能維持到120 min。

(3)本研究選用 4個靶向性評價指標評價OA-NPs對主要器官的靶向性，即TI、SI、Te和Re。TI和SI全面反映了各時間OA-NPs對主要器官的靶向性，但并未代表OA-NPs在整個觀察時間段內(nèi)對肝臟的靶性，即沒有反映藥物在體內(nèi)作用的全過程。Te和Re以AUC作為比較單位，可以反映藥物在整個觀察時間段內(nèi)的靶向性，能充分反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、消除等全過程。以上指標綜合考察，全面客觀地反映了OA-NPs對肝臟的靶向性。

(4)不少藥物體內(nèi)靶向分布研究采用同位素測定技術(shù)，原因在于該技術(shù)靈敏度高，生物樣品處理簡單，測定速度快，可進行大批量同時測定等優(yōu)點。但也存在測定結(jié)果重現(xiàn)性差、代謝物干擾、放射性污染及同位素效應(yīng)等問題。本試驗采用 RP-HPLC法測定，建立的方法樣品前處理簡單，在所選條件下，內(nèi)源性物質(zhì)與OA能得到很好的分離，測定結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，同時避免了由于放射性同位素的引入所導(dǎo)致的與原藥不同的體內(nèi)分布。

4 結(jié) 論

建立了測定生物樣品中 OA濃度的 RP-HPLC法。進行了OA-NPs、OA-SOLs在小鼠體內(nèi)的分布及靶向性研究。結(jié)果表明，OA-NPs對肝臟有良好的靶向性作用，其結(jié)果客觀可靠。

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［5］王婧雯. 齊墩果酸固體脂質(zhì)納米粒肝靶向性及藥效學(xué)研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文,2007:40-46.