中國耐多藥結核分枝桿菌二線抗結核藥物敏感性分析

趙冰 宋媛媛 逄宇 李強 歐喜超 夏輝 趙雁林

耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是全世界結核病控制工作面臨的重大難題，耐多藥結核病全球分布不均，中國和印度是世界上耐多藥疫情最為嚴重的兩個國家，上述兩國每年新發耐多藥結核病患者例數占全世界50%以上[1]。由于對一線藥物中的利福平(RFP)和異煙肼(INH)同時耐藥，耐多藥結核病的治療主要依靠二線抗結核藥物，特別是氟喹諾酮類和二線注射類藥物[2]。因此，了解一個國家或地區耐多藥患者對二線抗結核藥物的耐藥性，對于指導耐多藥患者形成有效的化療方案具有重要意義。前期文獻表明，不同國家地區的結核病患者對二線抗結核藥物的耐藥率差別較大。在韓國，耐多藥患者對氧氟沙星(Ofx)耐藥率超過40%[3]，而俄羅斯僅有1.3%的耐多藥患者對Ofx耐藥[4]，目前尚缺乏中國耐多藥患者中對二線抗結核藥物的耐藥狀況分析。

本研究選取2007年全國耐藥基線調查的耐多藥結核分枝桿菌菌株[5]，對其進行7種二線抗結核藥物敏感性試驗并分析，以了解我國二線抗結核藥物的耐藥率，為制定合理的耐多藥結核病化療方案和控制措施提供科學依據。

材料和方法

一、菌株來源

2007—2008年，國家結核病參比實驗室組織實施了全國首次耐藥基線調查[5]，2008—2009年國家參比實驗室采用比例法完成所有菌株對4種一線抗結核藥物[RFP、INH、鏈霉素(S)和乙胺丁醇(EMB)]和2種二線抗結核藥物[Ofx和卡那霉素(Km)]的傳統藥敏試驗。本研究從此次基線調查所收集的菌株中，選取了2008年4月至2008年7月全國耐藥基線調查點的126株耐多藥菌株，均為國家參比實驗室菌株庫中保藏。選用羅氏培養基對選取的菌株進行復蘇傳代。標準菌株H37Rv來自于國家參比實驗室菌株庫保存標準株。

二、主要試劑

羅氏培養基及分枝桿菌藥敏羅氏培養管均為國家結核病參比實驗室自制。配制藥敏培養基所用藥粉均購置于美國Sigma-Aldrich公司。

三、比例法藥物敏感性試驗

具體的操作依照參考文獻[6]進行。藥敏試驗中共包括2種一線抗結核藥物和7種二線抗結核藥物，具體濃度如下：S：4.0 μg/ml；EMB：2.0 μg/ml；Ofx：2.0 μg/ml；Km：30.0 μg/ml；卷曲霉素(Cm)：40.0 μg/ml；乙硫異煙胺(Eth)：40.0 μg/ml；丙硫異煙胺(Pto)：40.0 μg/ml；環絲氨酸(Cs)：30.0 μg/ml；對氨基水楊酸(PAS)：1.0 μg/ml。每批藥敏試驗選取H37Rv菌株作為對照。對菌株的藥物敏感性結果判斷標準如下：耐藥百分率=(含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的菌落數)×100%。如果耐藥百分率<1%，則認為受試菌對該抗結核藥物敏感；如果耐藥百分比>1%，則認為受試菌對該抗結核藥物耐藥。

四、統計學分析

采用SPSS 15.0軟件進行統計分析，結核分枝桿菌對各種抗結核藥物的耐藥情況計數資料的組間比較采用卡方檢驗，當計數資料的頻數小于5的情形時，進行Fisher精確概率法檢驗，僅當P<0.05時，認為差異有統計學意義。

結 果

一、耐多藥菌株耐藥譜狀況

在126株耐多藥結核分枝桿菌菌株中，有60株(47.6%)分離于初治患者，其余66株(52.4%)分離于復治患者。傳統藥敏試驗結果表明，對于一線藥物S和EMB，總體耐藥率分別為73.0%和58.7%；對于二線藥物，Ofx和Eth耐藥率最高，分別為25.4%和23.0%；其次為Km和Cs，其耐藥率分別為17.5%和13.5%；最后為Cm、Pto和PAS，耐藥率均為3.2%。不同抗結核藥物耐藥率在初治和復治患者中具有可比性(P值均>0.05)，除Km和Cs。Km在初治患者和復治患者的耐藥率分別為33.3%和3.0%，統計表明兩者差異有統計學意義(χ2=20.025，P<0.01);此外，初治患者Cs耐藥率為21.7%，顯著高于復治患者的6.1%(χ2=6.558，P=0.017)(表1)。

表1 不同類別患者的耐多藥菌株藥物耐藥譜分析

注S：鏈霉素；EMB：乙胺丁醇；Km：卡那霉素；Ofx：氧氟沙星；Cm：卷曲霉素；Eth：乙硫異煙胺；Pto：丙硫異煙胺；Cs： 環絲氨酸；PAS：對氨基水楊酸

二、二線抗結核藥物交叉耐藥情況分析

對Km耐藥的12株中，有3株同時對Cm耐藥；而在對Cm耐藥的4株中，有3株同時對Km耐藥(表2)。

對Eth耐藥的29株中，有4株(13.8%)同時對Pto耐藥；而在對Pto耐藥的4株中，有4株同時對Eth耐藥。

表2 Km與Cm交叉耐藥情況分析(株)

注Km：卡那霉素；Cm：卷曲霉素

表3 Eth和Pto交叉耐藥情況分析(株)

注Eth: 乙硫異煙胺; Pto: 丙硫異煙胺

討 論

本研究結果顯示，我國分離的耐多藥結核分枝桿菌菌株對Ofx、Eth、Km和Cs具有較高的耐藥率。在我國多個地區進行的研究表明，山東省72.6%的耐多藥結核分枝桿菌對二線抗結核藥物耐藥[7]；河南省耐多藥結核病患者對二線抗結核藥物Ofx和阿米卡星(Am)的耐藥率達48.1%[8]，上海市耐多藥結核病患者中，對Ofx、Km的耐藥率分別為38.4%和14.3%[9]，武漢市耐多藥患者中，分別有26.8%和5.3%的患者對Ofx和Km耐藥[10]。與上述資料比較，本研究結果低于山東和河南的監測結果，與上海和武漢的結果相近。上述差異反映出我國不同地區耐多藥菌株對于二線抗結核藥物的耐藥率差別較大，經濟發達地區的耐藥率較低，而經濟欠發達地區的耐藥率較高。耐藥率高低通常反映一個地區耐多藥結核病診斷能力狀況，同樣也可作為抗結核藥物化療效果評價。一方面，對耐多藥結核病患者的早期發現，特別是對患者標本中分離的菌株進行準確的傳統藥物敏感性試驗(DST)的結果將成為指導患者用藥的重要依據，我國“十二五”規劃中進一步加強地市級實驗室開展傳統藥敏試驗的能力，將有效解決對耐藥患者，特別是耐多藥患者的診斷問題。根據藥敏試驗結果合理制定耐多藥患者的化療方案，將對提高耐多藥患者療效、減少二線藥物耐藥情況的發生有重要意義；另一方面，治療的規范性對患者的治療轉歸情況有重要影響。分析上述耐多藥患者的治療方案及患者后續隨訪情況，將有助于不同地區制定有效的耐多藥患者管理方案。此外，菌株的來源可能也會影響其耐藥率，來自專科醫院就診的患者的耐藥率高于來自于CDC的患者，上述因素也可能影響研究結果。

在分析初治和復治耐多藥患者的耐藥率時，筆者發現初治耐多藥患者對Km和Cs的耐藥率顯著高于復治耐多藥患者。初治耐多藥患者為首次就診并接受抗結核治療者，因此，其所感染的致病菌應為其他患者傳播而來。這種不同患者耐藥率的差異可能反映出對Km和Cs耐藥的菌株具有更強的傳染性，然而受限于本研究中樣本量相對較少，對更大樣本的耐多藥菌株的耐藥率分析將有助于證實上述推論。

Km和Cm同屬于二線注射類抗結核藥物。與前期研究結果一致，本研究表明兩者間存在單向交叉耐藥，大部分Cm對耐Km的菌株仍然敏感；Cm是一種有效的抗結核藥物，而且不良反應小，因此在對氨基糖苷類抗結核藥物耐藥率較高的地區，可以考慮使用Cm[12-13]。Eth與Pto同屬屬二線異煙酸衍生物類抗結核藥物，研究表明Eth和Pto存在交叉耐藥，但與INH無交叉耐藥性。本研究發現Eth和Pto存在單向耐藥，對Pto耐藥的菌株全部對Eth耐藥，而對Eth耐藥的菌株僅有13.8%同時對Pto耐藥。雖然硫代異煙酰胺類抗結核藥物Pto和Eth抗結核作用僅為INH的1/5，但是由于耐多藥菌株對INH耐藥現象比較普遍，因此上述兩種藥物成為治療耐多藥結核病化療方案中的重要組成部分[12]。本研究結果提示，選取Pto可能比應用Eth具有更好的適用性和抗菌效能。

綜上所述，中國耐多藥結核分枝桿菌菌株對二線抗結核藥物具有較高的耐藥性，特別是Ofx和Eth。這對結核病控制，特別是耐多藥結核病控制帶來嚴峻的挑戰，也提示在耐多藥結核病患者中應開展二線抗結核藥物敏感性檢測，從而為耐多藥患者形成合理的化療方案提供依據。

參 考 文 獻

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