106份狗牙根材料的SRAP分析

張延輝，李江華，孫 強，帕提古麗，阿不來提

（1.新疆農業大學 草業與環境科學學院/新疆草地資源與生態重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區烏魯木齊市公安局，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆維吾爾自治區草原總站，新疆 烏魯木齊 830052）

狗牙根（Cynodon dactylon）是暖地型草坪草中最重要的草種之一，且在世界各地廣泛種植，狗牙根屬共有9個種10個變種［1］。我國華南、華中、西南、西北、華北南部均有狗牙根分布［2］。不同地域的狗牙根即使在同一種內仍然存在著及其豐富的遺傳變異。評價一種種質資源的遺傳多樣性，對深入了解該資源的種群結構、變異程度、居群豐富度，開展核心種質庫的構建及優良性狀的選育工作具有重要的意義。新疆南北疆各地均有狗牙根分布，這些野生狗牙根的不同居群在形態、地域環境上差別很大，表現為不同的生態型，阿不來提將分布于南北疆平原綠洲不同生態條件下的狗牙根分為伊犁型（北疆型）和喀什型（南疆型）兩大類［3］。目前，新疆狗牙根的研究工作涉及各方面，包括形態、抗性、生理［4，5］等，但分子水平方面的研究剛剛起步，筆者僅就部分野生材料進行了SRAP標記研究，而較全面的評價新疆地區的狗牙根材料，亟需在建立較完整種質資源圃的情況下利用分子標記技術探究其遺傳變異，從DNA水平評價其遺傳多樣性。

相關序列擴增多態性（SRAP）標記方法具有簡便、中等產量、高共顯性、易于分離條帶及測序，不需預知物種的序列信息等優點［6］。相比于SSR標記，其引物開發的成本大大降低，而且該技術主要針對ORF開放閱讀框設計引物，對內含子、外顯子及啟動子區域進行擴增，比較穩定。目前，在草坪草的選育上，運用該技術開展多樣性研究還較少。Budak等［7］利用34對SRAP引物組合分析了53份野牛草種質的遺傳多樣性及其與表型的關系。易楊杰等［8］對四川、重慶、貴州、西藏4省區的野生狗牙根材料進行了遺傳多樣性分析。

利用SRAP標記技術對106份狗牙根材料進行遺傳多樣性研究，旨在揭示不同野生狗牙根材料間的親緣關系，遺傳背景、變異程度及遺傳多樣性水平，為選育優良的狗牙根新品種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的狗牙根材料共106份，部分采自新疆不同地區，部分引自國內外其他地區，狗牙根材料編號及來源見表1。2008年5月將供試的狗牙根材料種植于新疆農業大學試驗場原始資源圃，小區面積1.0m×2.5 m，小區間距70cm，期間進行灌溉、雜草防除等田間管理工作。

表1 106份野生狗牙根的采集地點Table 1 The collection areas of 106bermudagrass accessions

續表1

1.2 試驗方法

采用CTAB法［12］提取樣品總 DNA，從238對SRAP引物組合篩選出14對多態性較好的組合用于PCR擴增，采用10μL反應體系，反應液含1.4μL 10×Buffer，0.25mmol/L dNTP，1μmol/L引物，0.2U的Taq DNA聚合酶及15ng模板DNA。SRAP－PCR擴增在PTC2200（MJ，USA）PCR儀上完成。

擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，35℃復性1min，72℃延伸1min，循環5次；94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1min，循環35次；72℃延伸10min，4℃保存。擴增產物加3μL上樣緩沖液，用6%非變性PAGE電泳檢測，上樣量3 μL，3μL 100bpLadderMarker。電壓200V，電泳約60min，采用銀染，數碼相機照相記錄結果。同時設置不含DNA樣本的陰性對照（用ddH2O代替DNA），以確定每次PCR實驗時材料的DNA是否存在自擴增或污染。

1.3 數據統計分析

根據擴增產物的條帶有或無分別賦值，有帶的記為1，無帶的記為0，獲得二元數據矩陣。利用NTSYS－pc2.1統計分析軟件計算不同材料間的遺傳相似系數（GS）。根據GS值按非加權平均距離（UPGMA）進行遺傳相似性聚類分析，利用POPGENE軟件進行各項遺傳參數的統計分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果及擴增效果的比較

通過對14對正向引物，17對反向引物進行兩兩組合，共形成238對引物組合。通過對該引物組合進行篩選，共獲得14對多態性較高、條帶清晰、穩定性和重復性好的引物組合（表2），運用該引物組合分別對106份材料的基因組DNA進行擴增。結果表明，14個引物組合共產生133條帶，平均每個引物產生9.5條，其中有123條顯示多態性，多態性百分率為92.5%，Nei’s基因多樣性指數（H）變異為0.244 2～0.499 8，平均為0.414 5（表3）。其中，引物組合Me21－Em13擴增的總位點最多，有12個，引物組合Me17－Em12和Me22－Em18多態性位點最少，僅有7個。供試的樣品具有不同的SRAP帶型，擴增片段在100bp～1 500bp，多態性檢出率較高。表明SRAP能檢測的遺傳位點比較豐富，初步表明新疆野生狗牙根在DNA分子水平遺傳多樣性很豐富。

表2 14對SRAP引物序列及其擴增結果Table 2 Sequences of 14SRAP primers and amplification results

表3 研究所用SRAP引物組合的擴增結果及多態性信息Table 3 Results and the polymorphism information of SRAP primer combinations used in the present study

2.2 遺傳多樣性分析

對SRAP－PCR擴增結果采用 Nei－Li相似系數（GS）的計算方法，得到相似性矩陣。供試材料之間差異明顯，具有較為豐富的遺傳多樣性（表4），有效等位基因數（Ne）在1.236 3～1.593 8，Nei′s基因多樣性指數（H）在0.159 0～0.347 4，Shannon信息指數（I）在0.254 0～0.516 7，表明新疆野生狗牙根材料種內存在廣泛的變異，其中以材料cd01多樣性最為豐富，Nei′s基因多樣性（H）為0.347 4，Shannon信息指數（I）為0.516 7。

表4 SRAP標記分析狗牙根的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of native bermuda grass by SRAP mark

續表4

續表4

2.3 聚類分析

根據14對引物組合的PCR擴增結果，基于遺傳相似系數，利用UPGMA法繪制出供試材料SRAP標記遺傳多樣性分子聚類圖（圖1）。從聚類圖上可以看出，106份供試材料在L＝0.51時，可以分成3個組：在第1大組中，共計90份材料，被分成了3個亞類。其中，來自伊犁的一種材料和采自華南的材料單獨聚為一類（cd001和cd128），而且距離其他材料較遠。聚類結果顯示，不同來源地的材料也有聚在一起，如cd16、cd20；也有部分來源地相同的材料聚在不同的亞類中，如cd15、cd114、與cd117，說明來源地相同的材料有可能是同一種材料，其遺傳相似度極高，但不同來源的材料也聚在一大組中，說明這些材料有一定程度的變異。在第2組中，共計15份材料，cd37自為一類，而cd32、cd49、cd50聚在一起，遺傳基礎較為相似，這些材料普遍來自氣候較熱的地區，比如哈密、吐魯番，說明具有較一致的生態型的材料容易聚到一起。在第3組中cd129自成一類，同其他材料遺傳距離較大，親緣關系比較遠。從聚類結果也可以看出，SRAP標記對材料的區分能力及鑒別的準確性比較好。

圖1 106份狗牙根材料UPGMA聚類圖Fig.1 Dendrogram of 106genotypes from the UPGMA cluster analysis

3 討論與結論

3.1 新疆狗牙根的多態性

利用SRAP標記技術分析了106份狗牙根材料的遺傳多樣性，從238個引物組合中篩選出多態性高的14個引物組合，共擴增出123條多態性條帶，定位了523個多態性位點，其中多態性條帶比例為92.5%，表明新疆野生狗牙根資源具有較高的遺傳多樣性。已有的一些研究結果在多態性統計上有一些差異。凌瑤測定的中國西南5省區的44份野生狗牙根及8份非洲狗牙根材料的多態性位點為87.29%［9］；易楊杰對野生狗牙根種質研究，多態性條帶比例為79.8%［8］。周少云等［10］應用ISSR標記對廣東地區30份野生狗牙根進行遺傳多樣性研究，多態性條帶比率達93.7%。這些研究結果的差異主要與不同地域野生狗牙根材料本身具豐富的遺傳變異，以及材料樣本選取量大小有關。

3.2 狗牙根的遺傳相似性

根據此次試驗的結果，106份狗牙根的遺傳相似性GS值在0.36～0.94，平均為0.65。齊曉芳等［11］利用AFLP標記對采自非洲以及中國四川、重慶、云南、貴州和西藏5省區的共44份野生狗牙根材料進行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數（GS）為0.64～0.95，平均GS值為0.76。新疆野生狗牙根部分材料間的相似系數較低，遺傳距離很遠，表明狗牙根種內具有大量可供遺傳變異選擇的基因型，這為選育優良品種提供了良好的基礎。

3.3 新疆狗牙根遺傳變異與地理來源的相關性分析

物種的遺傳變異和地理生態環境之間的關系一直是植物種群遺傳學普遍關注的問題，目前，多數研究認為物種的基因與種質的地理分布間存在有一定的相關性［12］。劉偉等［13］將西南區42份野生狗牙根材料的遺傳距離矩陣和與之對應的地理距離矩陣進行相關分析，結果表明大部分野生狗牙根材料的遺傳距離與地理來源之間無嚴格的一致性關系。筆者所得結論認為材料與地理之間有一定的相關性，聚類結果可以在一定程度上反映與地理距離之間的聯系。聚類結果比較發現，在大的類群劃分上表現出一定的一致性，但在類群內表現出較大的差異。生境相近的大部分品種，在SRAP分子標記上也能聚在一起，而且在地理位置上越接近的品種，在二者的一致性上表現得越顯著，相同或相鄰生境較易聚在一起的。如吐魯番、托克遜、哈密等地的材料。在所有的材料中，以來自伊犁的材料遺傳多樣性最豐富，分布在兩個大組中，這可能與伊犁地區地域特點有關。因此，在做聚類分析時應結合形態、生理生化數據及地理特征進一步分析。

［1］ Boune J M.Morocco’s native perennial turf grasses are a treasure trove of diversity and they’re disappearing［J］.Diversity，2000，16：53－54.

［2］ 劉建秀，賀善安.暖季型草坪草種質資源的研究與改良［J］.國外畜牧學－草原與牧草，1996（3）：12－30.

［3］ 阿不來提，石定燧，楊光，等.新疆野生狗牙根研究初報［J］.新疆農業大學學報，1998（2）：124－127.

［4］ 孫宗玖，阿不來提，齊曼，等.狗牙根新品種抗寒性評價及生理基礎研究［J］.中國草地，2003（4）：25－30.

［5］ 孫宗玖，阿不來提，齊曼，等.冷害脅迫下3個狗牙根品種抗寒性比較研究［J］.草業科學，2004（1）：39－42.

［6］ Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：271－282.

［7］ Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，et al.Molecular characterization of Buffalo grass germplasm using sequence－related amplified polymorphism markers［J］.Theor Appl Genet，2004，108：325－361.

［8］ 易楊杰，張新全，黃琳凱，等.野生狗牙根種質遺傳多樣性的SRAP研究［J］.遺傳，2008，30（1）：94－100.

［9］ 凌瑤，張新全，齊曉芳，等.西南五省區及非洲野生狗牙根種質基于SRAP標記的遺傳多樣性分析［J］.草業學報，2010，19（2）：196－203.

［10］ 周少云，黃春瓊，劉國道.廣東地區野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR分析［J］.熱帶作物學報，2010，31（5）：797－802.

［11］ 齊曉芳，張新全，凌瑤，等.野生狗牙根種質資源的AFLP遺傳多樣性分析［J］.草業學報，2010，19（3）：155－161.

［12］ Wilson B L，Kitzmiller J，Rolle W，et al.Isozyme variation and its environmental correlates in Elymusglaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139－153.

［13］ 劉偉，張新全，李芳，等.西南區野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR標記與地理來源分析［J］.草業學報，2007，16（3）：55－61.