板栗花粉黃酮的精制及其質(zhì)譜分析

郭麗梅，王盼盼

(天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300457)

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的天然植物成分，為植物多酚類的代謝物，大多有顏色，其相對(duì)分子質(zhì)量較低且具有多種生理活性，如抗氧化、抗自由基、抗癌、抗炎、抗病毒和降血糖等[1–2]．黃酮類化合物對(duì)高血壓引起的頭痛、項(xiàng)強(qiáng)、頭暈、耳鳴等癥狀有明顯的療效[1]．黃酮在板栗花粉中含量較高[3]，是板栗花粉中值得研究的一類具有生物活性的化合物[4–6]．常用的提取黃酮的方法為醇提法[7]．分析黃酮的方法主要有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法等[8–13]．其中分光光度法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較少，可用于總黃酮的檢測(cè)．液相色譜質(zhì)譜法分離效率高，分析速度快，檢測(cè)靈敏度高，可用于黃酮種類及黃酮含量的檢測(cè)．

本研究采用板栗花粉作為原料，采用醇提法對(duì)其中的黃酮進(jìn)行了提取，并采用分光光度法檢測(cè)總黃酮的含量，用高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)提取的黃酮進(jìn)行定性檢測(cè)，為板栗花粉黃酮的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及儀器

板栗花粉，承德暢達(dá)天然營(yíng)養(yǎng)品有限公司；AB–8大孔樹脂，南開大學(xué)化工廠；乙醇、乙腈、超純水等試劑，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；蘆丁、楊梅黃酮、槲皮素等標(biāo)準(zhǔn)品，南京替斯艾么中藥研究所．

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；VIS–723G可見分光光度計(jì)，北京福利儀器分析公司；Waters 3100液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理

先用95%乙醇浸泡12,h，然后用蒸餾水洗至無(wú)醇味，再用 4%鹽酸溶液浸泡 12,h，用蒸餾水洗至中性后，用 4%NaOH溶液浸泡 12,h，用蒸餾水洗至中性，置于4,℃冰箱備用．

1.2.2 黃酮提取工藝[14]

取破壁板栗花粉 5,g置于四口燒瓶中，加入50,mL 70%乙醇溶液，70,℃水浴加熱提取1.5,h，過(guò)濾得濾液Ⅰ．重復(fù)提取 1次得濾液Ⅱ，合并濾液得到黃酮粗提液．

1.2.3 純化工藝

取 20,mL預(yù)處理好的大孔樹脂裝柱，取 10,mL粗提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用4,mL 70%乙醇進(jìn)行溶解，濕法上樣，用 200,mL蒸餾水淋洗，然后依次用 140,mL體積分?jǐn)?shù)分別為 60%、70%、80%的乙醇淋洗[15]，流量為1,mL/min，收集乙醇部分，得到乙醇洗脫液．

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液：稱量 120,℃下烘干的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.025,0,g，用 95%乙醇溶解，定容于 50,mL容量瓶中，質(zhì)量濃度為0.5,mg/mL．

取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于 25,mL容量瓶中，加水 6,mL后再加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1,mL，搖勻，靜置 6,min；加入 10%的Al(NO3)3溶液1,mL，搖勻，靜置6,min；再加入4%的NaOH 溶液 10,mL，加水定容，搖勻，靜置 15,min；4,000,r/min離心10,min，以不含蘆丁的空白溶液為參比溶液，采用可見分光光度法在波長(zhǎng) 510,nm 處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]．

將提取液在相同的方法下測(cè)定吸光度(A)．由回歸方程算出總黃酮類化合物質(zhì)量濃度．取 40,mL的黃酮粗提液或者乙醇洗脫液蒸干，計(jì)算旋蒸瓶前后的質(zhì)量差(m)，蒸干后固體中總黃酮含量(P)按照式(1)計(jì)算：

1.2.5 液相色譜–質(zhì)譜分析

色譜條件：Waters 3100高效液相色譜儀，PDA 2998檢測(cè)器，Waters 2767收集和進(jìn)樣系統(tǒng)，Waters symmetry C18色譜柱(5,μm，150,mm×4.6,mm)，流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%的甲酸乙腈溶液，流量為 1,mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 280、350,nm，流動(dòng)相的洗脫程序見表1．

質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓3.00,kV，離子源溫度110,℃，錐孔電壓30,V，抽取器電壓3,V，去溶劑化溫度 300,℃，載氣為高純氮?dú)猓撊軇饬髁髁?50,L/h，反吹氣流量 50,L/h．電離方式為電噴霧(ESI)，正離子掃描模式，掃描范圍質(zhì)荷比(m/e)為85～1,500．

表1 梯度淋洗程序Tab.1 Process of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物中總黃酮含量

按 1.2.4方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為A＝9.416,5,X－0.008,8，R2＝0.999,6．不同濃度乙醇淋洗所得總黃酮的含量見表2．

表2 不同濃度乙醇淋洗所得總黃酮的含量Tab.2 Content of flavonoids and ethanol concentrations in elution

由表2可知，粗提液中黃酮的含量為13.39%，使用大孔樹脂純化后，總黃酮含量均有提高，較佳的洗脫液濃度為 70%乙醇，將 70%乙醇的洗脫液濃縮，重復(fù)純化兩次，得到黃酮含量為 78.12%的液相色譜-質(zhì)譜待測(cè)液．

2.2 液相色譜–質(zhì)譜檢測(cè)黃酮種類

黃酮類物質(zhì)在 280、350,nm 左右為典型吸收峰，因此同時(shí)出現(xiàn)在兩個(gè)波長(zhǎng)下的峰為黃酮峰，其他峰為雜質(zhì)峰，將待測(cè)液在1.2.5液質(zhì)條件下分析(圖1)．從圖 1可以看出，黃酮峰的保留時(shí)間為 6.63、6.97、7.43、7.87、8.25、8.50,min(取 350,nm 下的保留時(shí)間)．雜質(zhì)在 280,nm 下有較強(qiáng)的干擾作用，相比于350,nm的譜圖，該波長(zhǎng)下各峰的分離情況較差．

黃酮類物質(zhì)在正離子模式中通常表現(xiàn)出加氫峰[M＋H]+，加鉀峰[M＋K]+或者加鈉峰[M＋Na]+的形式，并且在 ESI電離方式得到的譜圖為一級(jí)質(zhì)譜圖，通常產(chǎn)生較大的碎片離子和分子離子峰，可從譜圖中 找到各物質(zhì)相應(yīng)的分子離子峰．

圖1 待測(cè)液的液相色譜圖Fig.1 HPLC of the extraction

依據(jù)參考文獻(xiàn)[16–18]，總結(jié)出板栗花粉中可能存在的黃酮種類見表3．

通過(guò)表3可以看出，板栗花粉中可能存在的黃酮有 6種，不考慮黃酮與其他物質(zhì)的結(jié)合，花粉中檢測(cè)到的黃酮為槲皮素、山奈酚、異鼠李素以及楊梅黃酮4種．為了進(jìn)一步確定4種黃酮的存在，將4種黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品在相同的質(zhì)譜條件下檢測(cè)，得到的標(biāo)準(zhǔn)譜圖與樣品譜圖中的離子峰進(jìn)行比較，結(jié)果見表4．

表3 板栗花粉中可能存在的黃酮及分析Tab.3 The kinds and analysis of flavonoids contained in chestnut pollen

表4 標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)譜中的行為及與樣品質(zhì)譜圖對(duì)照Tab.4 The behavior of standard substance and the samples

由表4可以初步斷定，板栗花粉中可能存在的黃酮為山奈酚、槲皮素、異鼠李素以及楊梅黃酮等．

3 結(jié) 論

經(jīng)液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測(cè)，初步可斷定板栗花粉中含有的黃酮種類主要為山奈酚、槲皮素、異鼠李素以及楊梅黃酮，存在的形式多為游離態(tài)與葡萄糖、鼠李糖等糖的結(jié)合．粗提液經(jīng)過(guò)大孔樹脂純化后總黃酮的含量由 13.39%提高到 78.12%，較佳的洗脫體系可選為200,mL蒸餾水和140,mL 70%乙醇，依次洗脫，流量為1,mL/min．

［1］ 裴凌鵬，惠伯棣，金宗濂，等. 黃酮類化合物的生理活性及其制備技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2004，25(2)：203-207.

［2］ 陳華，鄭軍. 槲皮素對(duì) HepG2細(xì)胞的抑制作用及對(duì)耐藥基因和 P-糖蛋白的影響[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7(9)：791-794.

［3］ 武首香，包秀萍. 板栗花粉總黃酮提取及 HPLC 定量[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31(6)：270-272.

［4］ 陳玉瓊，李安琪，孟燕. 大孔樹脂純化藤茶黃酮及主要成分結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 食品科學(xué)，2009，30(9)：51-55.

［5］ 韓薇妍，魏超，趙有璽，等. 蜂花粉中總黃酮和SOD 酶的測(cè)定[J]. 食品科技，2009，34(7)：257-265.

［6］ 徐秀廷，趙玉英，李廣環(huán)，等. 蕎麥花水溶物中黃酮的提取及含量測(cè)定[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27(2)：658-660.

［7］ 唐德智. 黃酮類化合物的提取、分離、純化研究進(jìn)展[J]. 中藥與天然藥物，2009，21(12)：101-104.

［8］ Chen Haifang，Zhang Wugang，Yuan Jinbin，et al. Simultaneous quantification of polymethoxylated flavones and coumarins in Fructus aurantii and Fructus aurantii immaturus using HPLC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，59：90–95.

［9］ 高淑云，程熙. 麻葉千里光中總黃酮的測(cè)定分析[J].食品科學(xué)，2009，30(24)：316-319.

［10］ 龔葉南. 分光光度法測(cè)定蜂花粉中的總黃酮[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(2)：121-124.

［11］ Hasegawa T，Tanaka A，Hosoda A，et al. Antioxidant C-glycosyl flavones from the leaves of Sasa kurilensis var.gigantea[J]. Phytochemistry，2008，69(6)：1419–1424.

［12］ 張瑞，胡娜娜，邢軍. 薄層色譜法和硅膠柱層析法分離新疆紫花苜蓿中黃酮類化合物的研究[J]. 食品科技，2011，36(1)：177-180.

［13］ 木努爾丁·托合尼牙孜，艾爾肯·艾米爾，依米提·熱合曼. 新疆產(chǎn)蜂膠總黃酮的提取工藝優(yōu)化及 GC-MS分析[J]. 食品科學(xué)，2011，32(2)：132-135.

［14］ 包秀萍，郭麗梅，白玉琢，等. 板栗花粉總黃酮的分離純化工藝研究[J]. 杭州化工，2010，40(1)：29-31.

［15］ 田寶娟，王孟歌，康永勝. 茶花蜂花粉中總黃酮的提取與含量測(cè)定[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2009，26(2)：303-305.

［16］ 任順成，查磊. 玉米花粉黃酮類的精制及其質(zhì)譜分析[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，31(4)：1-4.

［17］ 楊潔，陳純，邢建軍，等. 油菜蜂花粉中黃酮類化合物提取與鑒定[J]. 食品科學(xué)，2010，31(22)：273-278.

［18］ 楊開，葉興乾，劉東紅，等. 油菜蜂花粉中黃酮苷類的制備分離和鑒定[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2010，25(8)：91-97.