海南省和河南省發生甜瓜褪綠黃化病的分子鑒定

劉珊珊 彭斌等

摘 要：【目的】為了探明引起海南省和河南省甜瓜褪綠黃化的病因，【方法】提取從海南三亞和河南鄭州采集的甜瓜葉片的RNA，用CCYV特異性引物進行外殼蛋白基因的克隆、測序，并與GenBank中同屬或同種病毒的cp基因核苷酸序列構建系統進化樹。【結果】結果顯示，RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，所得條帶在880 bp左右，與預期的一致；構建cp基因的系統進化樹發現，樣品與瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）的親緣關系很近，屬于同一個分枝，而與該病毒同屬不同種的南瓜黃矮失調病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV）和大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV） 的親緣關系較遠，屬于不同的分枝。【結論】證實海南省和河南省甜瓜褪綠黃化病是由瓜類褪綠黃化病毒引起。

關鍵詞： 甜瓜； 瓜類褪綠黃化病毒； 外殼蛋白基因； 黃化

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0291-03

瓜類褪綠黃化病是一種近年爆發的新病害，病原為瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）。該病毒屬于長線病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），通過煙粉虱以半持久性方式傳播，已知在自然界主要侵染葫蘆科作物的甜瓜、西瓜、黃瓜。植物感染CCYV后，通常中下部葉片先感染，逐步向上發展，新葉常無癥狀。葉片開始出現褪綠， 隨著病情發展，葉片黃化，同時仍能看見保持綠色的局部組織， 最后全葉黃化，但葉脈仍保持綠色。該病害最早于2004年在日本發現[1]，我國于2007年，在上海、寧波發現，目前已分布于廣西、江蘇、山東、浙江[2]和臺灣[3]，此外該病在蘇丹[4]和黎巴嫩也有發生。關于該病害在我國的南北分布仍然不清楚，2011年我們實地調查海南三亞和河南鄭州的甜瓜病毒病發生情況，觀察到設施甜瓜普遍發生黃化。從發病的大棚采集病葉，通過病毒外殼蛋白基因（cp）的克隆和序列分析，證實樣品系CCYV病毒感染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2011年3月在海南三亞樂東縣佛羅鎮長流村、福塘村、鶯歌海、尖峰鎮；2011年10月在河南鄭州河南農業大學實驗園區采集表現褪綠黃化的甜瓜葉片，編號分別為SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1，保存于-80 ℃。

1.1.2 試劑 M-MLV反轉錄酶、dNTPs、RNAiso Plus試劑、TaqDNA聚合酶、Ribonuclease Inhibitor和T載體pMD18-T等分子生物學試劑，產品購自寶生物工程有限公司；75%乙醇（DEPC處理水配制）、氯仿、異戊醇等均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA的提取 參照TaKaRa RNAiso Plus試劑盒的說明，從所采集的甜瓜葉片中提取總RNA。稱取0.2 g樣品于干熱滅菌的研缽中加液氮研磨，加700 μL的RNAiso Plus后勻漿，靜置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，取上清加入140 μL的氯仿振蕩混勻，靜置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清并加入等體積的異丙醇，靜置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。加入1 mL的75%乙醇洗滌沉淀，12 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，棄上清保留沉淀，晾干，溶解于30 μL的DEPC處理水中。

1.2.2 cp基因擴增 根據GenBank發表的CCYV的cp序列，設計一對特異性引物CP-F： CGTAAGTGATCGCAATCAAT，CP-R： AGTGATCACTTGACCATCTCC，擴增片段長度876 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

以提取的總 RNA 為模板進行反轉錄，反應體系為10 μL。向經過DEPC處理的0.2 mL的離心管中加入3 μL RNA、1 μL CP-R 10 μmol·L-1、3.5 μL dNTPs 25 mmol·L-1、2 μL 5×M-MLV Buffer、0.2 μL的RNA酶抑制劑 40 u·μL-1和0.3 μL的M-MLV反轉錄酶200 u·μL-1，42 ℃水浴1 h。

PCR反應采用15 μL體系，含ddH2O 7.7 μL、10×PCR緩沖液 1.5 μL、dNTPs 2.5 mmol·L-11 μL、反轉錄產物2.5 μL、10 μmol·L-1的CP-F和CP-R各1 μL、5 u·μL-1 Taq DNA聚合酶 0.3 μL。反應條件為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 變性1 min、58 ℃ 退火1 min、72 ℃ 延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃總延伸10 min。

1.2.3 目的片段的回收 PCR產物經1%的低熔點瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后在凝膠成像系統上觀察、拍照，用大連寶生物工程有限公司的小量DNA片段快速膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.4 PCR產物克隆 PCR產物回收后與pMD18-T連接，連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞。37 ℃培養14～16 h，挑取單菌落，37 ℃ 200 r·min-1培養，3～5 h后PCR鑒定轉化結果，轉化成功的菌液送到上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.5 序列分析 利用DNAMAN軟件比較所得序列與GeneBank中CCYV的cp基因序列的相似性。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR結果

采用RT-PCR方法對從河南與海南采集的甜瓜葉片進行檢測，經瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，產物大小在880 bp左右，與預期的一致2.2 核苷酸序列測定與同源性分析

對含有擴增片段克隆的大腸桿菌菌液進行序列測定，獲得了SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1 5個CCYV分離物的部分基因組序列。擴增的片段長876 bp，包含完整的cp基因序列（4941～5693nt；753 bp）和部分cpm基因序列（5693～5740 nt；48 bp）。

用DNAMAN將所得的5個分離物的cp基因的核苷酸序列與GenBank中提交的所有CCYV以及該病毒同屬的南瓜黃矮失調病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus， CYSDV）和大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus， BYDV ）的cp基因核苷酸序列構建系統進化樹發現這5個分離物與CCYV的親緣關系很近，屬于同一個分枝，而與CYSDV和BYDV的親緣關系較遠，屬于不同的分枝，因此可以確定該病毒是CCYV。

3 討 論

瓜類褪綠黃化病最早于2004年在日本由Okuda等[1]發現，直到2010年病原才被發布，該病由CCYV引起。2007年秋季，在我國寧波、上海、山東發生甜瓜、西瓜和黃瓜的大面積黃化，通過研究證明這些地區發生的瓜類黃化病原是CCYV[2]。世界上目前已知該病害分布于日本、蘇丹、黎巴嫩、中國，在我國分布于廣西、江蘇、山東、浙江和臺灣。由于煙粉虱傳播的病毒病害容易大范圍、大地域的傳播發生，我們認為除上述這些地區外，可能會有更大范圍的傳播和分布，因此調查中國最南部的海南省和中部的河南省，發現秋季種植的甜瓜均發生大面積黃化，這些黃化的癥狀和病害發生流行的特點與Gu等[2]報道過的中國沿海省份地區如寧波、上海和山東所發生的瓜類黃化病相同，因此推測是同一種病害。本實驗通過對從海南三亞、河南鄭州采集的樣品進行CCYV cp基因克隆和序列分析，證實CCYV在海南、河南這兩省均有發生。

瓜類褪綠黃化病毒由煙粉虱以半持久的方式進行傳播，僅由成蟲帶毒，該病的發生與病害發生地煙粉虱的發生有著很大的關系，病害發生季節與煙粉虱大發生時期相一致。B型和Q型煙粉虱傳播該病毒，而Q型煙粉虱傳播的作用可能更大，因此對煙粉虱生物型分布的了解將有助于此病害發生地的調查研究。目前還沒有發現種子攜帶該病毒的情況，而該病害的發生季節性非常明顯，主要集中在8—10月份，與大多數地區的煙粉虱大爆發時期一致，同時我們觀察到春季也有發生，這應該取決于瓜類作物種植的環境，如果是溫室周年種植瓜類作物，那么也會引起春季發生該病害。

由于該病害是新突發病害，關于該病害的研究還非常少，加強該病害流行學方面的研究無疑有利于我們控制病害。從該病毒在世界及我國的分布來看，該病害已經在許多地方分布，所以了解該病毒的遠距離傳播方式對防止該病害進一步蔓延有著重要意義。

本試驗結果表明，海南三亞、河南鄭州發生瓜類褪綠黃化病，說明該病害可能分布于南至海南北至河南的所有地區。隨著病害的蔓延，極可能會在更大的地域分布。因此監測與控制該病害，對于西瓜、甜瓜、黃瓜的產業持續健康發展是非常重要的。

參考文獻 References：

[1] OKUDA M， OKAZAKI S， YAMASAKI S， OKUDA S， SUGIYAMA M. Host range and complete genome sequence of Cucurbit chlorotic yellows virus， a new member of the genus Crinivirus[J]. Phytopathology，2010，100（6）： 560-566.

[2] GU Q S， LIU Y H， WANG Y H， HUANGFU W G， GU H F， XU L， SONG F M，BROWN J K. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus in cucumber， melon， and watermelon in China[J]. Plant Disease， 2011，95（1）： 73.

[3] HUANG L H，TSENG H H ， LI J T， CHEN T C. First report of cucurbit chlorotic yellows virus infecting cucurbits in Taiwan[J]. Plant Disease， 2010，94（9）： 1168.

[4] HAMED K，MENZEL W，DAFALLA G， GADELSEED A M A， WINTER S. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus infecting muskmelon and cucumber in Sudan[J]. Plant disease， 2012，95（11）：1321.