綠色木霉菌發酵液對杧果炭疽菌胞內抗性酶活性的影響

劉淑宇 于新等

摘 要： 【目的】為了探索綠色木霉菌（Trichoderma viride）發酵液對杧果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）胞內抗性酶活性的影響，【方法】以C. gloeosporioides為供試菌，加入T. viride發酵液，終濃度為MIC50值（1.0% v/v），測定0.0～30.0 h內C. gloeosporioides胞內CAT、POD、PPO、SOD、PAL和脫氫酶活力。【結果】T. viride發酵液抑制胞內抗性酶活性，致使細胞膜保護系統損壞，胞內物質大量外泄，最終抑制或殺死病菌。經T. viride發酵液處理的C. gloeosporioides，30 h后，胞內CAT、POD、PPO、PAL和脫氫酶活力分別比對照組低52.54%、23.62%、58%、6.38%、6.52%、44.74%。【結論】T. viride發酵液可顯著降低C. gloeosporioides胞內抗性酶活力，抑制C. gloeosporioides生長。

關鍵詞： 綠色木霉菌； 發酵液； 杧果炭疽菌； 抗性酶活

中圖分類號：S667.7 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪02-0285-06

杧果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）是杧果等多種熱帶、亞熱帶水果采前及采后的主要病原真菌之一，具潛伏侵染性，可引起貯藏期間的杧果30%～50%腐爛。中國、美國、印度、巴西、菲律賓、泰國、印度尼西亞、剛果等國均有報道。人們已經研究了肉桂[1]、石菖蒲[2]、香根草[3]等植物提取物對炭疽菌菌絲生長、孢子萌發的抑制作用[4]，以及溫度、濕度[5]、光照[6]等因素對孢子萌發的影響，但植物提取物成本高，原材料受生長季節和地域的限制，難以在杧果采后保鮮處理的生產中推廣應用。利用拮抗微生物定向發酵技術，生產抑菌防腐物質的發酵條件和工藝皆可控制，為實現低成本果蔬采后生物保鮮劑的連續工業化生產提供了可能。

木霉菌（Trichoderma）是一類自然界普遍存在的真菌。其中，綠色木霉菌（Trichoderma viride）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）、康氏木霉菌（Trichoderma koningii）、鉤狀木霉菌（Trichoderma hamatum）和長枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）等對農作物田間真菌病害具拮抗作用[7-9]。T. viride具有適應性強，繁殖速度快、對植物病原真菌具廣譜拮抗作用等優點，已成為人們研究的熱點[10-11]。國內外對T. viride防治農作物田間病害的拮抗作用機理，以及應用進行了研究[12-14]，前人從3個方面對T. viride發酵液進行研究： 即T. viride發酵液發酵條件的優化、抑菌活性及穩定性[15-17]； T. viride發酵液對抑菌機理的研究[18-19]； T. viride發酵液對杧果采后保鮮的研究[20-21]。但至今尚未見T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內抗性酶活力影響的報導。我們探索T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內CAT、POD、PPO、SOD、PAL等抗性酶活力的影響，以期探求其抑制C. gloeosporioides的生化作用機制，為T. viride發酵液在杧果采后保鮮上的應用提供理論研究依據。

1 材料和方法

1.1 材料

綠色木霉菌 （T. viride），購于廣東省微生物研究所；杧果炭疽菌（C. gloeosporioides Penz），華南農業大學微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 T. viride發酵液的制備 參照蔣雨[15]的方法，培養基配方：200.0 g馬鈴薯，10.0 g玉米粉，20.0 g葡萄糖，1.0 g吐溫-80，1.0 L水。T. viride經活化培養，制成106 CFU·mL-1孢子懸液，250 mL錐形瓶中加50 mL培養基，接種量1.0%（v/v），于32.5 ℃，125 r·min-1，培養7 d。發酵液經孔徑0.22 μm濾膜過濾，除去孢子，50 ℃真空旋轉蒸發濃縮至1/25體積，得樣液，4 ℃貯存備用。

1.2.2 C. gloeosporioides菌種培養 參照Latoud等[22] 的方法，將C. gloeosporioides接種于PDA培養基中，28 ℃培養3 d，刮孢子于PDA液體培養基中，28 ℃ 125 r·min-1培養72 h。

1.2.3 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內過氧化氫酶活性的影響 參照前人[18，23-24]方法，培養好的C. gloeosporioides經 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于PBS緩沖液中，加T. viride發酵液樣液，使終濃度達MIC50值[15，18]。以等體積無菌水為對照。分別于0.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，于4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。取含0.01 g·L-1 H2O2的磷酸鹽緩沖液 （0.1 mol·L-1 pH7.0） 2.0 mL置30 ℃下保溫30 min，加1.0 mL酶液，于240 nm（DU730紫外及可見分光光度計，美國Beckman coulter Inc）處測吸光值。

1.2.4 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內過氧化物酶活性的影響 參照汪金蓮等[25]方法，培養好的C. gloeosporioides經 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于PBS緩沖液中，加T. viride發酵液樣液，使終濃度達MIC50值[15，18]。以等體積無菌水為對照組。分別于0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，上清液為粗酶液。取1mL上清液，加1 mL 0.05 mol·L-1 H2O2，，2 mL 40 g·L-1愈創木酚，25 ℃反應5 min，470 nm處測吸光度。

1.2.5 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內多酚氧化酶活性的影響 參照黃卓烈等[26]方法，粗酶提取方法同1.2.4，以1 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚為底物，加入2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 7.0），1 mL酶液，30 ℃保溫10 min，加1 mL 20 mg·mL-1 H2O2，525 nm處測吸光度。

1.2.6 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內超氧化物歧化酶活性的影響 參照嚴萬里等[27]方法，培養好的C. gloeosporioides經 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于PBS緩沖液中，加T. viride發酵液樣液，使終濃度達MIC50值[15-17]。以等體積無菌水為對照組。0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，即為SOD粗提液。取4.5 mL緩沖液，4.2 mL蒸餾水加入試管中，25 ℃保溫25 min，加0.3 mL 0.1 mmol·L-1（以10 mmol·L-1 HCl配制）預熱的鄰苯三酚，迅速搖勻，于325 nm處測吸光度。

1.2.7 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內苯丙氨酸解氨酶活性的影響 參照王寶通等[28]方法，培養好的C. gloeosporioides經 4 000 r·min-1，離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于0.2 mol·L-1、pH 8.8的硼酸緩沖液（含40 g·L-1 PVP，2 mmol·L-1 EDAT和5 mmol·L-1 β-琉基乙醇）中，加T. viride發酵液樣液，使終濃度達MIC50值[15-17]。對照組添加等體積無菌水。0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。反應體系中依次加入：1.6 mL 50 mmol·L-1、pH 8.8硼酸緩沖液、1 mL 30 mmol·L-1 L-苯丙氨酸，37 ℃保溫平衡5 min，加2.4 mL粗酶液。290 nm處測吸光值作為反應的初始值，37 ℃保溫60 min。再次測定290 nm吸光值作為終止值。根據吸光度值變化，用酶促反應產物trans-肉桂酸生成量表示PAL酶活性。

1.2.8 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內脫氫酶活性的影響 參照楊天佑等[29]方法，培養好的C. gloeosporioides經 4 000 r·min-1離心10 min，收集幼嫩菌絲體。重懸浮于0.2 mol·L-1、pH 8.8的硼酸緩沖液（含40 g·L-1 PVP，2 mmol·L-1 EDAT和5 mmol·L-1 β-琉基乙醇）中，加T. viride發酵液樣液，使終濃度達MIC50值[15-17]。對照組添加等體積無菌水。0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h取樣，超聲破碎8 min，4 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。反應體系為：2 mL上清液，1.5 mL Tris-HCl緩沖液（1 mmol·L-1，pH 8.0），0.5 mL 3.6 g·L-1 Na2S2O4，2 mL 4 g·L-1 TTC，迅速將其放入37 ℃水浴振蕩器內震蕩培養30 min，加1 mL甲醛終止反應，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，向反應體系中加3 mL丙酮萃取10 min，3 000 r·min-1離心5 min，于485 nm處測吸光值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內過氧化氫酶活性的影響

在需氧生物體內，過氧化氫酶（CAT）作為活性氧清除劑，可減免細胞在脅迫下所受到的損傷。試驗期間，C. gloeosporioides胞內CAT活性整體呈上升趨勢，但發酵液處理組增幅遠小于對照組。30 h后，對照組及發酵液處理組的C. gloeosporioides胞內CAT活力分別為22.24、14.58 U·g-1。分別比初始值增加95.56%、39.29%，差異顯著（P<0.01）。

2.2 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD）存在于需氧生物體內，可抵御外界不良因素對生物體構成損傷的功效試驗初期，菌體細胞中POD活性較低，6 h后POD活性增幅較大，培養30 h后，發酵液處理組POD活性比對照組降低23.62%。

2.3 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶（PPO）普遍存在于植物和微生物體內。逆境下，PPO可將酚類物質轉為更具毒性的醌，且參與生物體內多種生理生化反應，以抵御或降低不利因素對生物體的損傷作用。由圖3可見，在試驗過程中，C. gloeosporioides胞內PPO活性整體呈上升趨勢，且T. viride發酵液處理組PPO活性明顯低于對照組。30 h后，經發酵液處理的杧果炭疽菌體內PPO活性為0.74 U·g-1，比對照組低58%，差異顯著（P<0.01）。

2.4 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）為生物體內有效的超氧自由基清除劑，在細胞防御體系中起重要作用。在0～30 h試驗時間內，C. gloeosporioides胞內SOD活性整體呈下降趨勢，且發酵液處理組降幅大于對照組。培養30 h后，對照組、發酵液處理組C. gloeosporioides胞內SOD活力分別比初始值降低25.44%，36.13%（P<0.01）。此時，處理組SOD活力低于對照組6.52%。

2.5 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內苯丙氨酸解氨酶活性的影響

苯丙氨酸解氨酶（PAL）參與細胞內酚類物質的合成，加速苯丙烷類物質的代謝，抵御不良因素對生物體的侵害。圖5所示，試驗期間，C. gloeosporioides胞內PAL活性整體呈上升趨勢，0～18 h時， PAL活性增幅較大，之后較為平緩，且整個試驗過程中，對照組增幅遠大于發酵液處理組。30 h后，發酵液處理組苯丙氨酸解氨酶活力為9.41 U·g-1，比對照組低6.38%（P<0.01）。

2.6 T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內脫氫酶活性的影響

微生物活力指標評定中，胞內脫氫酶活力可被用于表征細胞呼吸強度及活力水平，其活力的升高與菌群數量的增長速率呈正相關。試驗期間，2組C. gloeosporioides胞內脫氫酶活性整體呈上升趨勢，與對照組相比，試驗組脫氫酶由于受到T. viride發酵液的影響，活力遠低于對照組。培養30 h，試驗組酶活力比對照組低44.74%。

3 討 論

研究T. viride發酵液對C. gloeosporioides胞內抗性酶活力的抑制作用，探索T. viride代謝抗生物質對病原菌抑制的作用機理。

CAT廣泛存在于動植物和微生物細胞膜上。逆境下，機體CAT活性增強。催化H2O2分解為氧和水，減輕活性氧所造成的損傷。試驗中，隨著T. viride發酵液處理時間的延長，C. gloeosporioides胞內CAT酶的活力呈先上升后下降趨勢。30 h后，發酵液處理組CAT酶活力比對照組低34.42%。同汪金蓮等[25]在茶多酚對稻瘟病菌抑制效果的研究。可能是由于T. viride發酵液的作用， C. gloeosporioides的細胞膜結構完整性受損[18]，細胞膜的屏障以及酶系保護功能喪失，致使胞內物質大量外泄。

POD 酶存在于需氧生物體內，屬細胞保護酶系統，可清除活性氧自由基，對于抵御多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、維護膜結構的完整性均有重要作用。多酚氧化酶（PPO）可將酚類物質氧化產生具有更強抑菌力的醌類物質；參與苯丙烷類衍生物代謝以及類黃酮和生物堿的合成等生理生化過程[26]。30 h培養，T. viride 發酵液處理組中，C. gloeosporioides胞內POD、PPO酶活力均低于對照組。可能是由于T. viride發酵液處理破壞菌體細胞膜系統、使得菌體酶蛋白更易受到內外環境的影響，進而誘使微生物的正常代謝紊亂。

SOD酶可清除細胞中多余的超氧陰離子，抵御氧自由基毒害[28]。試驗期間，對照組、發酵液處理組SOD酶活性分別下降25.44%，36.13%。生物體中，PAL為酚類物質合成的關鍵酶，可加速苯丙烷類物質的代謝，在機體抗逆性反應中起重要作用。整個試驗過程中，PAL活性呈整體下降趨勢，且發酵液處理組比對照組低6.38%。這可能與發酵液中抑菌物質作用的“孔道形成”有關。在一定的膜電位下，抑菌物質吸附于C. gloeosporioides細胞膜上，其C末端侵入膜內形成通透孔道，允許分子量小于0.5kDa的親水分子流入，進而導致細胞膜去極化及ATP的泄露，細胞外水分子流入，造成細胞內溶質迅速滲漏，細胞自溶而死亡[30-31]。

脫氫酶活性是衡量微生物呼吸生理代謝活力的重要指標。TTC法測定脫氫酶活性是表征細胞代謝活力的一種有效方法[29，32]。研究發現T. viride發酵液處理使C. gloeosporioides細胞膜受損嚴重，膜透性增強。酶蛋白及核酸等物質由胞內大量泄漏出來，最終導致病原菌死亡[18]。本試驗中，發酵液處理組脫氫酶活性比對照組低44.74%，可能是由于發酵液中的抑菌物質干擾了C. gloeosporioides呼吸代謝，進而抑制其生長或導致死亡。

4 結 論

C. gloeosporioides 是杧果果實采前及采后的主要病害之一，嚴重影響了杧果的產量和質量。本試驗利用T. viride發酵液處理C. gloeosporioides，并分別選取0.0 h、6.0 h、12.0 h、18.0 h、24.0 h、30.0 h對C. gloeosporioides 胞內CAT、POD、PPO、SOD、PAL和脫氫酶活性進行測定。結果表明，T. viride發酵液可降低杧果炭疽菌CAT、POD、PPO、SOD、PAL和脫氫酶的活性，抑制C. gloeosporioides的生長。其作用機理可能為：發酵液處理誘使C. gloeosporioides細胞結構完整性破壞，胞內物質外泄，最終導致菌體細胞凋亡。

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