杧果炭疽病菌漆酶基因lac1的克隆與序列特征分析

韋運謝 劉曉妹等

摘 要：【目的】為了探明膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）漆酶基因（lac1）的序列特征，進一步研究膠孢炭疽菌的分子致病機制，【方法】以杧果炭疽病菌為材料，采用同源克隆、SEFA-PCR和RT-PCR技術對lac1基因進行擴增、并對所獲得的lacl基因進行了序列特征和預測蛋白保守結構域的分析。【結果】結果表明，該基因DNA和cDNA全長分別為2 996 bp、1 773 bp，編碼區含3個內含子（大小分別為47 bp、50 bp和59 bp），推測編碼590個氨基酸，其分子質量約為1174.50 kDa，等電點PI為5.36。系統進化樹結果顯示該基因編碼的氨基酸序列與多種真菌的含銅氧化物酶聚為一類，其中與C. lagenarium laccase （BAB32575.1）的同源性最高，達73%。【結論】lac1基因具備真菌漆酶基因家族的序列特征，推測lac1基因可能參與調控C. gloeosporioides菌絲生長、色素生成和致病性等。

關鍵詞： 杧果； 膠孢炭疽菌； 漆酶；克隆； 序列分析

中圖分類號：S667.7 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980

漆酶（p-diphenol oxidase， Laccase）是一種含銅的多酚氧化酶，屬多銅氧化酶（multicopper oxidase）家族，廣泛存在于擔子菌、半知菌和子囊菌中以及一些昆蟲、細菌及黃蜂的毒液中[1]。漆酶活性與真菌孢子的萌發、色素生成、木質素降解利用有關，同時漆酶還可以保護病原真菌免受寄主植保素和鞣質等化合物的影響，在真菌對環境的適應和定殖過程中起著重要作用[2-3]。

杧果是世界第二大熱帶水果，其收獲面積及產量僅次于香蕉。由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）引起的杧果炭疽病是世界杧果產區的重要病害，在果園常引起植株梢枯、葉枯及落花落果，在貯運期病果率為30%～50%、甚至100%，嚴重影響杧果的產量和品質，是限制杧果產業發展的主要因素之一[4]。隨著分子生物學技術的發展，已經鑒定并克隆了該病原菌一些致病相關基因[5]，但未見關于漆酶基因方面的研究。本研究的目的是用同源克隆等方法，從C. gloeosporioides中克隆漆酶基因，并通過生物信息學分析預測其功能，為下一步研究其在C. gloeosporioides致病過程中的作用打下基礎，以便我們更好地了解C. gloeosporioides與杧果之間的互作機制，最終為杧果炭疽病防治提供新的作用靶標。

1 材料和方法

1.1 材料

杧果炭疽病病菌膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides Penz.）單孢菌株A2，由中國熱帶農業科學院環植所熱帶果樹病害課題組鑒定、提供。

1.2 方法

1.2.1 杧果炭疽病病菌菌絲的收集與核酸的提取

收集用PDA培養4～5 d的菌絲。DNA的提取按照BioMiga Fungal gDNA Kit說明書操作。RNA的提取按照參照AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit操作。

1.2.2 從基因組擴增lac1基因片段 參照文獻[6]，設計lac1基因上下游引物：lac-F（5′-GGA ATTCTGGTAYCACAGCCACTT-3′）和lac-R（5′-GGAATT CTCRTGGCCRTGAAGRTG-3′）。以C. gloeosporioides基因組DNA為模板，擴增體系（50 μL）： 10×PCR Buffer 5 μL；dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）4 μL；lac-F （10 μmol·L-1）和lac-R （10 μmol·L-1）各1 μL；TaKaRa Taq 0.5 μL；DNA模板1 μL；加ddH2O補至50 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃，8 min。PCR產物的凝膠回收、連接分別按照TIANGEN和TaKaRa相應試劑盒說明書操作。

1.2.3 SEFA-PCR 獲得lac1基因全長 參照文獻[7]快速染色體步移法（Self-Formed Adaptor PCR， SEFA-PCR）引物設計原理，根據已獲的lac1基因片段序列設計擴增5′端和3′端的引物。擴增5′端引物：5A2L1 （5′-CCACAGCATTGACGCCCTTTCCG-3′）； 5A2L2（5′-AGTCGCTGATGGCATAAGGACCGAG-3′）；5Hemin-A2L3（5′-GATGAAAAGTGGNNNNNN NNNCTGTGA-3′）。擴增3′端引物：3A2L1（5′-TGGACTCCCTACCCAACCAGGATACCCC-3′）；3A2L2（5′-TCACTCCCCACAAGAACATTCTCGACG -3′）；3Hemin-A2L3（5′-GAAGAATTACACTTTNNNNNNN NNCATGGA -3′）。

1）SEFA-PCR第一步的擴增： 擴增體系（30 μL）：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ Plus） 3.0 μL，dNTP Mixture （各2.5 mmol·L-1） 3.0 μL，Hemi-A2L3（10 μmol·L-1） 1.0 μL，模板DNA 1.5 μL，TaKaRa LA Taq（5 U·μL-1） 0.5 μL，補ddH2O至30 μL。擴增條件：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 3 min，以每秒增加0.2 ℃的速度升至70 ℃， 70 ℃ 5 min。取出PCR管加入1.0 μL 引物A2L1（10 μmol·L-1）后繼續擴增，擴增條件：94 ℃ 30 s，70 ℃ 5.5 min，25個循環。接下來進行8輪不對稱PCR，擴增條件：94 ℃ 30 s，70 ℃ 5.5 min，2個循環；94℃ 30 s，50 ℃ 30 s，1個循環；8輪不對稱PCR完成后再70 ℃延伸5 min。

2）SEFA-PCR第二步的擴增： 擴增體系（30 μL）：引物A2L2（10 μmol·L-1）1.0 μL，模板為第一步擴增產物1.5 μL，其余同第一步擴增。擴增條件94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s（5端）/62 ℃ 30 s（3端），72 ℃ 5 min，33個循環；72 ℃ 10 min。

1.2.4 序列拼接與驗證 利用DNAssist 1.0軟件將所得5′端和3′端序列與lac1基因片段序列拼接獲得其初步的全長序列。再從兩端設計引物，用高保真酶擴增、測序，驗證已獲得序列的正確性。

1.2.5 RT-PCR法擴增獲得lac1的cDNA序列 用DNAssist 1.0軟件對所得lac1基因全序列與GenBank中的瓜類炭疽菌（C. lagenarium）的lac1基因cDNA序列（登錄號：AB055709.1）比對分析后，用推定的cDNA序列設計引物對A2Rlac1（5′-TTGGATACACGCACGGATTG-3′）和A2Rlac2（5′-AACTGCACGCTGAGACCC-3′），按照TIANScript cDNA First-Stand Kit說明書操作，擴增lac1基因的cDNA片段并克隆、測序。

1.2.6 lac1序列分析 利用DNAssist 1.0軟件比對分析所獲得的lac1基因DNA和cDNA序列，找出開放讀碼框、Kozak序列、起始密碼子、終止密碼子、外顯子、內含子。利用BioEdit軟件分析lac1基因編碼序列的化學特征。用Primer 5.0軟件推測lac1基因編碼的氨基酸序列。用ExPASy軟件包中Computer PI/MW軟件對該蛋白序列組分進行分析。

2 結果與分析

2.1 lac1基因片段擴增結果

用引物對lac-F和lac-R，以杧果炭疽病菌膠孢炭疽菌基因組DNA為模板擴增約1 000 bp片段這與所預測的序列長度相一致。用Blastn 分析發現，該片段與多個不同物種的漆酶基因序列有很高的相似性，說明該片段為膠孢炭疽菌漆酶基因片段，定名為lac1基因片段。

2.2 SEFA-PCR 獲得lac1基因全長

根據已獲得的lac1片段序列設計SEFA-PCR引物，經過兩步成功擴增獲得該片段上下游側翼區域測序表明，5′端序列長1 147 bp，3′端長1 214 bp。

2.3 RT-PCR擴增獲得lac1的cDNA序列

經RT-PCR擴增獲得約1 700 bp的cDNA片段測序表明大小為1 773 bp。該序列已提交在GenBank上，登錄號為JQ762259.1。

2.4 lac1序列分析

2.4.1 lac1基因全長DNA與cDNA序列分析 比對分析lac1基因DNA和cDNA序列，發現含1個1 773 bp大小的開放閱讀框，起始密碼子ATG位于381～383 bp處，終止密碼子TAA位于2 308～2 310 bp處，自ATG到TAG的DNA全長1 930 bp，其中存在3個大小分別為47 bp、50 bp和59 bp的內含子（位于583～629 bp，785～834 bp和977～1035 bp處），是典型的真菌內含子的長度（49～85 bp），所有內含子均符合GT-AG法則。

用BioEdit軟件分析結果表明，lac1基因編碼序列的雙鏈核苷酸分子質量大小為1174.50 kDa，（G+C）mol%為55.57%，（A+T）mol%為44.43%，可見該編碼區富含GC堿基，其中C的摩爾百分含量為31.67%。

2.4.2 lac1基因預測蛋白的化學特征分析 用Primer5.0軟件預測lac1基因編碼590個氨基酸。分子質量約為65.46 kDa，包括65個強堿性氨基酸（KRH），65個強酸性氨基酸（DE），235個非極性氨基酸（AILPWVFM），355個極性氨基酸（CDEGHKNQRSTY），等電點（PI）為5.36，可見是一種酸性蛋白質，富含極性氨基酸，特別是蘇氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）的含量分別達8.97%和8.46%。

2.4.3 lac1基因預測蛋白的同源性分析 將該基因編碼的氨基酸序列提交NCBI進行BLASTP同源比對，分析表明該漆酶與已發表的C. lagenarium laccase （BAB32575.1），Glomerella graminicola M1.001 multicopper oxidase （EFQ28232.1），Magnaporthe oryzae 70-15 laccase-2（EHA55280.1），Verticillium dahliae VdLs.17 laccase-1（EGY13352.1）和V. alboatrum VaMs.102 laccase-2 （XP-003008743.1）基因編碼蛋白同源性較高，相似性在50%以上。其中與同屬的瓜類炭疽菌聚為一小分支，親緣關系最近，相似性達73%。按物種分類地位進行聚類：進化樹可分為兩大分支，上一分支主要是子囊菌，而下一分支主要是半知菌。系統聚類結果表明（圖4）：lac1預測蛋白可能與瓜類炭疽菌（C. lagenarium）的laccase類或禾生炭疽菌（G. graminicola）的multicopper oxidase聚為一類。

2.4.4 lac1基因預測蛋白的保守結構域分析 利用NCBI的Blast軟件（http：//www.nebi.nlm.nih.gov/strueture/cdd/wrpsb.cgi）進行lac1基因預測蛋白的結構域分析（圖5），發現該蛋白中含有Cu-oxidase保守結構域，說明LAC1蛋白屬于含銅的氧化物酶類。

3 討 論

目前已知的漆酶基因大部分通過RACE技術獲得的，本研究參考SEFA-PCR技術，結果顯示，與其他從已知片段擴增5′和3′技術如RACE、Gene-walking 和TAIL-PCR等相比，該方法簡單方便、經濟、可靠性高，更適合擴增已知序列的側翼序列。

漆酶廣泛存在于植物和真菌中，植物漆酶參與木質素的合成及原生質體再生過程中細胞壁的重建[8]，而真菌漆酶的功能較為多樣，Lentinus edodes 分泌的漆酶參與子實體形成[9]，Botrytis cinerea分泌的漆酶及板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）分泌的胞內和胞外漆酶與其致病性相關[10]，Aspergillus nidulans 和 A. fumigatus的分泌漆酶參與分生孢子形成和發育過程中的色素合成[11]，Heterobasidion annosum的侵染性和漆酶的表達密切相關[12]，玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的漆酶對分生孢子的形成、附著胞的侵染力及其黑色素的合成等起著重要作用[13]。本文克隆的lac1基因編碼的蛋白與C. lagenarium 的lac1基因編碼的漆酶有很高的序列相似性，而C. lagenarium的lac1基因與該真菌的黑色素合成和致病性有關，因此推測杧果炭疽病菌的 lac1基因可能也有相似的功能。但由于杧果炭疽病菌與上述真菌在生活史、侵入寄主的方式、致病因子等方面均存在差異，該基因的具體功能還有待進一步研究。

真菌中往往存在多種漆酶同工酶，如尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）中存在6種同工漆酶[14]，小麥全蝕病菌（G. graminis var. tritici）中存在3種同工漆酶， Rhizoctonia solani中存在4種同工漆酶。同工酶基因序列和氨基酸序列也存在差異，如登陸號為EFQ28232.1和EFQ33805.1的禾生炭疽菌、為AAA33592.1和CAD70438.1粗糙脈孢菌的漆酶同功酶就有此特征。這可能是由于真菌漆酶多以同工酶形式存在，且由基因家族編碼，除保守結構域外，其他位點存在較多的序列變異，真菌可能在不同的環境條件下或生長發育的不同階段有選擇性地表達這些基因[13，15]。本研究只從杧果炭疽病菌膠孢炭疽菌中克隆到1個漆酶基因，是否也存在其他的漆酶同工酶基因有待進一步研究。

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