超細氯化鈉粉的BALB/C 小鼠骨髓微核實驗

吳占敖，范利娟，許華君，端禮榮

(1.解放軍第359 醫院口腔科，江蘇 鎮江212001;2.解放軍第359 醫院呼吸內科，江蘇 鎮江212001;3.中國鹽業總公司鎮江鹽化公司，江蘇 鎮江212001;4.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇 鎮江212013)

氣溶膠鹽療法是最近幾年從俄羅斯引進的一種控微氣候物理治療方法，其特點是利用干燥NaCl微粒氣霧在仿鹽礦氣候的環境內造成最佳的溫濕度條件，通過患者吸入而發揮其治療作用。目前，該法已作為一種治療哮喘、支氣管炎癥等呼吸道疾病的新型非藥物方法應用于臨床。其中發揮治療作用的是5 ～8 μm 大小的干燥氯化鈉氣霧顆粒［1]。為保障人體用藥安全，需要確定超細氯化鈉粉的安全性。小鼠骨髓微核試驗是藥品注冊技術規范國際協調會(International Conference on Harmonization，ICH)推薦的檢測致突變物質標準實驗，以小鼠骨髓嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)中的微核數目作為評價化學物質毒性的指標，具有經濟、快速、準確的特點［2-5]。本研究對BALB/c 小鼠連續予不同濃度的超細氯化鈉粉(pM 2.5-10)灌胃后，觀察小鼠骨髓細胞的毒性反應，并通過計算骨髓細胞的微核率，對超細氯化鈉粉進行安全毒理學評價。

1 材料與方法

1.1 材料

超細氯化鈉粉(pM2.5-10)為白色顆粒，溶于水，由江蘇省金壇鹽礦提供。環磷酰胺(CP)由上海華聯制藥有限公司生產;姬姆薩染液為上海江萊生物科技有限公司產品。

1.2 動物

6 ～8 周齡BALB/c 小鼠，雌性，清潔級，體質量18 ～20 g，由揚州大學比較醫學中心提供。自由攝水，室溫(24 ±2)℃，濕度45% ～65%，適應性喂養3d 后進行試驗。

1.3 小鼠急性毒性試驗

小鼠50 只，在預試驗基礎上，隨機分為3 個劑量組，超細氯化鈉粉劑量范圍為高、中、低(5.0、2.5、1.25 mg/kg)，另設正常對照組、陽性對照組，共5 組，每組10 只，試驗前禁食6 h，其中3 個劑量組經口灌服不同濃度的超細氯化鈉粉溶液，連續觀察14d，陽性對照組給予腹腔注射環磷酰胺(CP)40 mg/kg，正常對照組采用腹腔注射生理鹽水。記錄小鼠中毒表現及死亡情況。

1.4 小鼠骨髓細胞微核試驗

選用體質量18 ～20 g 雌性小鼠50 只，隨機分為5 組，每組10 只，超細氯化鈉粉劑量組(試驗組)經口灌服，給藥量分別為5.0、2.5、1.25 mg/kg，陽性對照組環磷酰胺的給藥量為40 mg/kg，采用腹腔注射，正常對照組采用腹腔注射生理鹽水。多次染毒，每天染毒1 次，連續5d，末次染毒后6 h 后用頸椎脫臼法處死小鼠，取股骨或取胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去每節骨骺，用小型彎止血鉗取骨髓涂片，固定，Giemsa 染色。在低倍顯微鏡下選擇細胞完整、分散均勻、著色適當的區域，用油鏡觀察，每張涂片計數約1000 個胞質清晰完整的嗜多染紅細胞(PCE)的微核率，結果以千分率(‰)表示。

1.5 統計處理

應用SPSS 16.0 統計軟件進行分析，微核率均以ˉ±s表示，采用單因素方差分析及χ2檢驗進行統計學處理，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠急性毒性及一般觀察試驗

由表1 可知，小鼠經口灌服不同劑量的超細氯化鈉粉后，5.0 mg/kg 組小鼠活動稍減弱，部分小鼠出現食欲稍減低，體質量在第2 天開始下降，但初始體質量(g)與5 天體質量(g)比較無明顯變化。2.5 mg/kg 組和1.25 mg/kg 組的體質量均無變化，與對照組比較，各超細氯化鈉粉處理組體質量均無明顯差異(P＞0.05)。各組均無小鼠死亡，小鼠生長良好。陽性對照組(CP)體質量減輕明顯(P＜0.05)。

表1 各組小鼠體質量的變化Tab 1 Changes of body weight in every group

2.2 小鼠骨髓細胞微核率的變化

陽性對照組(CP)微核細胞率為(111.6 ±25.5)‰，超細氯化鈉粉5.0 mg/kg 組微核細胞率為(13.7 ±2.89)‰，2.5 mg/kg 組為(9.1 ±2.99)‰，1.25 mg/kg 組為(8.2 ±3.05)‰，而正常對照組微核細胞率為(5.9 ±1.66)‰。與正常對照組比較，環磷酰胺組微核率明顯增高，差異有統計學意義(χ2=25.6，P＜0.001)。超細氯化鈉粉各劑量組間微核細胞數比較，差異無明顯統計學意義(P＞0.05)。超細氯化鈉粉各組與正常對照組比較，差異無明顯統計學意義(P＞0.05)，說明超細氯化鈉粉對小鼠骨髓PCE 無致突變作用。見圖1。

圖1 各組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核數(油鏡×400)Fig 1 Numbers of bone marrow micronucleus of mice

3 討論

無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內成為微核。這種情況的出現往往是受到染色體斷裂劑作用的結果［7]。微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。微核試驗作為檢測染色體損傷最常用而有效的細胞遺傳學檢測方法之一，已被當今多國和國際組織列為誘變試驗的常規方法，并將其規定為新藥、食品添加劑、農藥、化妝品等毒理學安全性評價的必做試驗［8]。近年來，鹽療的應用領域不斷拓展，一些知名的研究機構已加入到鹽療技術的開發過程中。本課題組前期實驗結果已顯示，天然礦鹽粉吸入療法能改善哮喘小鼠肺部炎癥［9]，本試驗進一步觀察超細NaCl 對小鼠的遺傳毒性，通過小鼠急性毒性、一般觀察試驗及微核試驗，未顯示超細氯化鈉粉對小鼠具有明顯毒性，特別是骨髓嗜多染紅細胞微核率未見明顯增加，表明在試驗劑量范圍內，超細氯化鈉粉無致突變性。本次實驗結果為將鹽粉應用于呼吸道疾病的治療提供了實驗依據。

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