特基拉芽孢桿菌來源β-1，3-1，4-葡聚糖酶重組菌發酵培養基的優化*

劉曉玲，王金晶，李永仙，朱林江，李崎

1(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學生物工程學院釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫，214122)

大麥作為一種重要的工業原料，被廣泛應用于啤酒釀造工業及飼料工業。但其胚乳細胞壁中含有的豐富的β-1，3-1，4-葡聚糖會對其應用造成一定的障礙，如麥芽中殘留的β-葡聚糖不但會降低麥汁的過濾速率，而且會造成成品啤酒的非生物渾濁。再者，飼料中使用大量大麥，由于動物體內沒有可降解β-葡聚糖的酶系，使動物消化道不能降解大麥細胞壁，降低飼料的利用率，同時可能導致家畜腸道疾病［1］。因此，在糖化過程中或飼料中添加適量的β-1，3-1，4-葡聚糖酶將有效緩解上述問題。目前市場上所使用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要來源于真菌發酵生產，價格較昂貴。構建高效表達的基因工程菌株生產β-1，3-1，4-葡聚糖酶成為研究熱點。山其木格等［2］將來源于地衣芽孢桿菌WS-6的β-1，3-1，4-葡聚糖酶在大腸桿菌BL21中成功表達，胞外酶活力為1 131.2 U/mL。李衛芬等［3］利用載體pET-30a在大腸桿菌中成功表達了浸麻芽孢桿菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，胞外酶活力為 60.4 U/mL。謝焱［4］、李永仙等［5］在大腸桿菌中表達了來源于淀粉液化芽孢桿菌BS5582的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，培養基優化后誘導表達酶活為1 570.83 U/mL。本實驗室選育的1株特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)，具有分泌 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的能力，經序列比對后發現該酶基因與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相似度為97.93%，與萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)相似度為94.24%，與淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS5582相似度為92.98%，與 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)相似度分別為89.3% 和85.6%，序列上傳GenBank后所獲登錄號JX412372。為進一步研究該葡聚糖酶的性質，將其基因在大腸桿菌中進行表達并獲得成功。本次研究采用響應面法(RSM)優化培養基組分，以期得到更好的表達效果，為重組β-1，3-1，4-葡聚糖酶的規模化生產及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET-28a(+)-bgl為本實驗室構建，用于表達來源于特基拉芽孢桿菌B.tequilensis CGX5－1的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl，其中bgl含有該酶自身信號肽序列，表達產物可直接分泌至胞外。

本次研究所使用種子培養基為LB培養基(tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0)，初始發酵培養基分別為TB培養基(yeast extract 24 g/L，tryptone 6 g/L，甘油 4 mL，蒸餾水 900 mL，KH2PO42.31 g/L，K2HPO42.54 g/L)、SB 培養基(yeast extract 30 g/L，tryptone 20 g/L，葡萄糖20 g/L)和M9培養基(參見分子克隆指南)。誘導劑為IPTG和乳糖［7－8］。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

菌種活化:取甘油保藏管中融化的菌液劃線至卡納霉素(濃度50 μg/mL)抗性平板上，37℃培養至形成明顯單菌落。

種子培養:挑取一單菌落接種至新鮮種子培養基(含終濃度50 μg/mL卡納霉素)中，37 ℃，200 r/min培養12 h，以4%接種量轉接至新鮮種子培養基(含終濃度50 μg/mL卡納霉素)中，培養至OD600=1.2～1.5時，即為種子液。

搖瓶發酵:將種子液以8%接種量轉移至發酵培養基(含終濃度50 μg/mL卡納霉素)中，37℃，200 r/min培養至OD600=1.0，加入誘導劑乳糖(終濃度8 mmol/L)和IPTG(終濃度0.06 mmol/L)后，于24℃低溫誘導發酵。

1.2.2 酶活測定方法

發酵液8 000 r/min離心3 min后取出上清液，用蒸餾水稀釋合理倍數后，于40℃預熱。用等體積預熱至40℃的20 mmol/L pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋的藍色大麥β-葡聚糖溶液(Megazyme公司)。取0.1 mL稀釋酶液加入0.4 mL藍色大麥β-葡聚糖底物中，于40℃反應10 min后向每個樣品中加入3 mL沉淀液(由硫酸鋅、乙二醇甲醚、鹽酸、乙酸鈉配制而成)后立即混勻，靜置5 min后離心，測定上清液A590值，對照組為先加入沉淀液后加入藍色大麥β-葡聚糖底物的稀釋酶液。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力的定義為:1 mL 發酵液于40℃、pH 6.0，每分鐘分解大麥β-葡聚糖產生1 μmol還原糖定義為1個酶活單位(U)。

1.2.3 響應面法實驗設計

本研究以β-葡聚糖酶活為因變量(Y)，TB培養基各組分為變量(X)，利用Minitab16軟件進行25－1部分重復因子設計，每一獨立變量在高(+1)和低(－1)兩個水平上進行實驗，設計結果如表1所示。

表1 部分因子設計編碼值及水平

將部分因子實驗結果與中心點實驗結果進行t檢驗，根據t檢驗結果進行最速上升實驗。

根據中心組合設計進行實驗后，對結果進行二次回歸擬合，得到平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，可在一定水平范圍內求出最佳值。二次回歸模型可表述為方程:

其中:Y為預測響應值，即發酵液β-葡聚糖酶的酶活;b0為截距，bi，bii，bij為回歸方程的線性系數、二次項參數和交互參數;xi和xj是實驗設計因子的編碼值。

通過響應面分析可以對影響β-葡聚糖酶合成的因素及其交互作用進行評價，并能對培養基各組分的濃度分別進行優化，以獲得影響過程的最佳配比。

2 結果與分析

2.1 重組大腸桿菌發酵培養基的選擇

在相同的培養條件下，培養基營養成分不同會直接影響細胞增殖，從而影響到產物的表達效率。為了獲得較高的生物量及表達效率，本研究使用TB、LB、SB及M9四種常見培養基進行重組菌的發酵培養，使用相同的誘導條件，結果如圖1所示。

圖1 重組大腸桿菌在不同培養基中的生長狀況Fig.1 Grouth curve of recombinant E.coli in different fermentation mediums

根據圖1中所得重組菌在個培養基中最大OD600值對照菌體干重與光密度校準曲線可知，在TB、LB、SB及M9培養基中最大生物量分別為6.79 g/L、1.72 g/L、2.59 g/L 及 1.28 g/L，胞外 β-葡聚糖酶活力最高值分別為1 671.9 U/mL、330.2 U/mL、375.3 U/mL及293.7 U/mL，由此可知TB培養基為最適發酵產酶培養基。

2.2 發酵培養基中碳源與氮源的選擇

為了進一步提高目的蛋白的表達量，本研究以TB培養基作為初始發酵培養基，對其成分進行優化。首先研究不同碳源物質如甘油、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、小麥粉、大麥粉及玉米粉等對β-葡聚糖酶產量的影響。各物質添加量均為5 g/L，由圖2可知，相同添加量下，以甘油為碳源時β-葡聚糖酶活力最高，可能是甘油作為小分子物質更易被細胞攝取并直接利用。而葡萄糖為碳源時酶活力最低，由于葡萄糖的分解代謝產物會對質粒中的lac操縱子造成阻遏效應，進而影響目的基因的表達。其他碳源物質如玉米粉、大麥粉等雖然產量也較高，但需額外添加高溫淀粉酶以消化原料，故不予采用。

圖2 不同碳源對β-葡聚糖酶表達量的影響Fig.2 Effects of different carbon source on the production of β-1，3-1，4-glucanse

圖3 不同氮源對β-葡聚糖酶表達量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source on the production of β-1，3-1，4-glucanse

保持TB培養基其他成分不發生變化，分別添加相同氮原子摩爾數的5種有機氮源和4種無機氮源。結果如圖3所示，使用無機氮源時β-葡聚糖酶活力僅為有機氮源最高酶活力的10%左右，可能無機氮源僅能維持細胞生長，而不能為大量合成的目的蛋白提供原料。Tryptone為進口培養基，而胰蛋白胨為國產培養基，雖同為胰蛋白胨，然二者對 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力影響明顯不同，分析后發現，二者的氨基酸種類并無差別，僅個別氨基酸含量差異較大，可能國產胰蛋白胨的純度較低，其微量雜質反而更有利于重組菌的生長。有機氮源中效果最顯著的為Yeast extract和胰蛋白胨，Yeast extract除了含有大量氨基酸外還有核酸、維生素類等微生物生長所必須的營養因子，相對而言，胰蛋白胨組成成分較為單一，考慮到二者在營養成分上可互補，故選擇兩者作為復合氮源。復合氮源配比實驗結果表明，當二者共同為復合氮源時β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力比單一氮源時高(數據未顯示)。李永仙［9］、房淑穎［10］在對重組大腸桿菌的培養基進行優化時，均使用復合氮源而非單一氮源，不但能夠提高目的蛋白產量而且會降低培養基成本。

2.3 部分因子設計及結果

表2 部分因子實驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of FFD

對部分因子實驗結果進行回歸分析可知，考察的因素中 Yeast extract和 KH2PO4對 β －1，3－1，4－ 葡聚糖酶合成具有負效應，故對這2個因素取低水平值。胰蛋白胨、甘油和 K2HPO4對 β －1，3－1，4－葡聚糖酶合成具有正效應，故對其取高水平值。實驗結果的方差分析如表3所示，其中P值小于0.05的因素可認為其對發酵結果的影響顯著。可知胰蛋白胨(0.001)和甘油(0.000)是顯著影響因子。

表3 部分因子實驗回歸分析結果Table 3 Regression results of FFD

由回歸分析結果可得一次擬合線性回歸方程:

實驗模型的回歸方程決定系數R2=92.9%，調整決定系數=90.4%，說明模型可以很好地解釋實驗結果。

2.4 最速上升實驗

從回歸方程中胰蛋白胨和甘油的系數(X2:55.5，X3:364)可以得這兩個因素步移的步長之比為(1∶6.56)，即當胰蛋白胨步移1個單位(1 g/L)時，甘油步移6.56 mL/L。以部分因子實驗設計的中心點作為步移的起點，實驗設計與實驗結果如表4所示。從實驗結果可以看出，步移啟動時β-葡聚糖酶酶活隨著胰蛋白胨與甘油濃度的升高而增加，在步移進行至第二步時達到最高點(2 915.2 U/mL)，之后β-葡聚糖酶活開始下降。步移最高點時胰蛋白胨與甘油的濃度分別為13 g/L和10.56 mL/L，這一點被用作響應面分析中心點

表4 最速上升實驗結果Table 4 Experimental results of steepest ascent path

2.5 中心組合設計及結果

以上研究利用部分因子設計確定了胰蛋白胨和甘油兩個顯著影響因素后，利用最速上升實驗確定了最優的取值范圍。此部分研究利用基于中心組合設計的響應面分析法對這兩個因素進行進一步的優化。

中心組合實驗設計及結果如表5所示，共有13個實驗點。13個實驗點可分為兩類:一類是析因點，即自變量取值在X2、X3所構成的三維頂點，共有8個析因點;另一類是零點，為區域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計實驗誤差。

表5 中心組合設計及結果Table 5 Design and results of central composite design

以胰蛋白胨和甘油為自變量，β－葡聚糖酶活為響應值，利用Minitab 16.0分析實驗數據，分析結果如表6所示，所得數學模型為:

表6 中心組合實驗回歸分析結果Table 6 Regression results of CCD

其中Y為響應值(β-葡聚糖酶酶活)，X2為胰蛋白胨濃度，X3為甘油濃度。回歸方程各項的方差分析表明，方程一次項與二次項的p值均小于0.05，說明胰蛋白胨與甘油的單獨影響與交互影響都較為顯著。實驗模型的回歸方程決定系數R2=96.65%，調整決定系數R2

Adj=94.26%，說明模型可以很好地解釋實驗結果。

2.6 響應面分析

對中心組合設計確定的各參數取值范圍進行響應面分析，所得結果如圖4所示。

由圖4可知在實驗取值范圍內2圖都有最大值(響應面的頂點或等高線的最高點)，即兩因子間的相互作用存在有利于β-葡聚糖酶酶活的最優組合。利用Minitab 16.0軟件預測功能對兩個因素的最佳值進行尋優，到當X2=12.5 g/L與X3=14.1 mL/L時，響應值β-葡聚糖酶酶活有最大值，預測值為2 935 U/mL。

圖4 胰蛋白胨和甘油與β-葡聚糖酶酶活的響應曲面及等值線Fig.4 The response surface plot and isolines for the effect of Tryptone and Glycerin on glucanase production

綜上研究結果可知，重組大腸桿菌發酵產β-葡聚糖酶的最適培養基成分為:Yeast extract 20 g/L，胰蛋白胨12.5 g/L，甘油14.1 mL/L，KH2PO42.17 g/L，K2HPO42.74 g/L。

2.7 響應面優化結果驗證

驗證實驗結果表明，初始培養基經過優化后，β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL)與初始培養基(1 671.9 U/mL)相比，提高了1.78倍，與2 935 U/mL的預測值較為接近，相對誤差為0.14%，同時證明了回歸方程的可靠性和統計學方法的有效性。

3 結論

重組大腸桿菌產β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最適培養基為TB培養基，與其它培養基相比，在TB培養基中生長狀況最好且酶活力最高。甘油為培養基的最佳碳源，其不僅為大腸桿菌的生長提供能量，而且能夠維持生長過程中細胞的形態，故而以此為碳源時發酵液上清中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力最高。Yeast extract和胰蛋白胨為培養基的最適氮源，二者為大腸桿菌的生長提供豐富的氨基酸、核酸等氮源，而且酵母粉中含有維生素等微生物必不可少的生長因子，這與程至敬等［11］的研究結果相符。為了提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的產量，研究采用響應面法優化TB培養基組分。結果表明，胰蛋白胨和甘油為顯著影響β-1，3-1，4-葡聚糖酶產量的因素，通過最速上升實驗及中心組合設計，結合響應面分析，最終得出TB培養基組分為:酵母粉20 g/L，胰蛋白胨12.5 g/L，甘油14.1 mL/L，KH2PO42.17 g/L，K2HPO42.74 g/L。使用優化后培養基發酵，上清中β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力較優化前提高了1.78倍，說明響應面優化效果較為理想。本次研究通過對發酵培養基的優化，使得重組菌發酵產β-1，3-1，4-葡聚糖酶的產量有所上升，對日后重組酶特性的研究及其規模化生產應用等工作的展開具有積極的意義。

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