湛江地區養殖南美白對蝦冷藏期間的菌相分析及優勢腐敗菌的初步鑒定*

田鳳，王玲

(廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江，524088)

南美白對蝦(Penaeus vannamei)學名凡納濱對蝦，是世界上三大產量最高、品質優良的對蝦養殖品種之一。它營養豐富、汁鮮肉嫩，且蛋白質含量高達20%，還含有豐富的微量元素和維生素A等成分，深受國內外消費者的喜愛［1］。由于對蝦含有大量的水分和豐富的蛋白質，捕獲后蝦肉中的營養物質如糖、脂、氨基酸等易被微生物分解產生有機酸、胺類以及硫化物等，形成不良的惡臭味甚至有毒物質，從而腐敗變質失去食用價值，這些微生物被稱為特定腐敗菌(SSO)或優勢腐敗菌［2］。在對蝦的冷藏過程中，優勢腐敗菌的生長速度比較快，并且會對營養物質的分解起決定作用。造成對蝦腐敗的微生物既與自身品種有關，還與它生長的水體環境有關，湛江作為全國最大的對蝦養殖基地，有關該地區養殖的南美白對蝦低溫冷藏保鮮時的菌相變化和優勢腐敗菌的分離鑒定的相關資料至今還未見報道。

本研究通過對湛江地區養殖的南美白對蝦冷藏過程中的菌相分析及優勢腐敗菌的分離和初步鑒定，為該地區養殖南美白對蝦冷藏冷凍保鮮產品貨架期的預測和靶向抑菌的保鮮方法提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 原料

鮮活南美白對蝦:采購于湛江東海養殖場。

對蝦采樣后盡快加氧保活運送至實驗室，挑取完整鮮活的個體，加冰猝死，去頭后流水沖洗，然后晾干并隨機分為7組，分別用保鮮袋包裝后于(4±1)℃條件下保藏。

1.2 試劑

NaOH、NaCl、HCl、計數瓊脂、營養瓊脂、革蘭氏染色試劑盒(北京陸橋)、1%鹽酸二甲基對苯二胺、1%a-萘酚-乙醇溶液、氧化發酵 O/F培養基、氧化三甲胺培養基(上海源葉)、美藍溶液、3%H2O2液等。

1.3 儀器和設備

雙面垂直超凈工作臺SW-CJ-2(上海綠宇);電熱鼓風干燥箱BGZ-146(上海綠宇);高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-SG46-280S(上海博訊);電熱恒溫培養箱HPX-9162MBE(上海博訊);電熱恒溫水浴鍋 HH.S11-2(上海博訊);生物顯微鏡XSP-2CA(上海光學儀器)。

1.4 分析和檢驗方法

感官評分:參照曹榮“對蝦生物保鮮與其熟制品保藏技術的研究”中對蝦感官評定標準進行［3］。

細菌總數測定(CFU/g):采用GB/T 4789.2－2010食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定的方法［4］。

平板劃線分離:參考張嫻等“活性污泥中細菌的分離、純化與培養”中平板劃線的方法進行［5］。

生理生化鑒定:按照Bagge-Ravn等提出的海產魚貝類細菌測定圖示［6］和《常見細菌系統鑒定手冊》［7］以及《伯杰細菌鑒定手冊》［8］進行。

1.5 實驗操作要點

1.5.1 南美白對蝦冷藏過程中的細菌總數測定

采用平板菌落計數法測定南美白對蝦冷藏過程中的細菌總數。對蝦經去頭清洗后分組，在(4±1)℃條件下冷藏，然后每天從冰箱中取出對蝦樣品一組，按照曹榮［3］的方法進行感官鑒定。取同組中的南美白對蝦適量，去殼，蝦肉勻漿后制成含菌樣液，然后按照黃秀梨等［9］主編的微生物學實驗指導進行10倍梯度稀釋。取適當稀釋倍數的樣液1 mL，與10 mL的計數瓊脂培養基混合，培養基需預先冷卻至50℃左右，使它既不凝固，又不會燙死樣液中的微生物。待混合有樣液的培養基凝固后于30℃倒置培養72 h，參照文獻［4］的方法計算細菌總數。

1.5.2 細菌的分離與鑒定

將菌落數為30～100個的計數平板上的細菌進行純化分離，之后將這些細菌按個體形態、菌落特征和革蘭氏染色結果進行分組，參照海產魚貝類細菌測定圖示［6］以及文獻［7－8］中關于細菌鑒定的方法，將每一組中的細菌進行相關的生理生化實驗，如氧化酶實驗、O/F發酵實驗、氧化三甲胺分解實驗、H2O2酶實驗等，初步鑒定到細菌的屬。

2 結果與分析

2.1 對蝦冷藏過程中細菌總數變化

將湛江地區養殖的南美白對蝦經預處理后在(4±1)℃條件下進行冷藏保鮮，每天取樣檢測其感官品質和細菌總數，結果見圖1。

由圖1可知，湛江地區養殖的南美白對蝦的初始含菌量為2.8×104CFU/g，(4±1)℃條件下冷藏1d后，細菌總數減少為3.4×103CFU/g，這是因為南美白對蝦在溫暖的水體環境中感染的某些嗜溫菌在冷藏時生長受到抑制，只有耐低溫的細菌才能大量繁殖;冷藏至第2天，細菌總數為5.1×104CFU/g，此時蝦肉品質較好，處于 GB 2733－2005［10］規定的一級鮮度;第3天時，細菌數量增長至4.5×105CFU/g，接近海蝦二級鮮度的上限;冷藏至4 d，細菌總數為3.0×106CFU/g，超過106CFU/g，到達貨架期終點;冷藏5 d以后，細菌總數的增長變得比較緩慢，可能是由于營養物質大量消耗和腐敗菌大量繁殖，抑制了其他微生物生長的緣故。冷藏至第6天，細菌總數高達2.4×107CFU/g，蝦肉完全腐敗變質，不能食用。

圖1 對蝦冷藏過程中細菌總數和感官評分變化Fig.1 Changes in bacterial amount and sensory score of Penaeus vanmamei during refrigerated storage

感官評定的結果與細菌總數的變化基本一致，第4天的感官評分為9分，參照文獻［3］，此時感官上已不可接受，貨架期結束;第6天的感官評分僅為4分，對蝦肌肉已腐敗，氣味和色澤也不可接受。本實驗條件下冷藏南美白對蝦的貨架期為4 d，這與曹榮等［11］的研究結果一致，而郭紅等［12］的研究表明，初始細菌總數不同，導致用更低的溫度保藏時其貨架期也為4 d，說明初始含菌量是影響貨架期的最主要的因素。

2.2 細菌的分組與鑒定

湛江地區養殖的南美白對蝦在(4±1)℃條件下冷藏時分離得到的細菌按形態特征、革蘭氏染色后可分為10組，將每組中的細菌進行生理生化鑒定，其結果見表1。

由表1可以看出，10組細菌形成的菌落大都是白色、圓形、粘稠、隆起、表面光滑、邊緣整齊且不透明的，但第Ⅴ組為黃色、第Ⅵ和第Ⅸ組為淺黃色菌落，Ⅶ、Ⅹ組菌落扁平、形狀不太規則且邊緣不完整，Ⅰ、Ⅵ組菌落半透明，Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ組菌落表面干燥且Ⅰ、Ⅵ、Ⅸ組產生難聞的臭味;通過革蘭氏染色和鏡檢可知，第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ組為 G－，Ⅱ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ組為G+，Ⅳ和Ⅷ組是球菌，其他為桿菌。由表1的菌落特征和生理生化實驗結果結合Bagge-Ravn等提出的海產魚貝類細菌測定圖示［6］可以初步判定，第Ⅰ組為假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、第Ⅱ組為乳酸菌屬(Lactic acid bacteria spp.)、第Ⅲ組為腸桿菌屬(Enterobacteriaceae spp.)、第Ⅳ組為葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、第Ⅴ組為黃桿菌屬(Flavobacterium spp.)、第Ⅵ組為希瓦氏菌屬(Shewanella spp.)、第Ⅶ組為棒桿菌屬(Corynebacterium spp.)、第Ⅷ組為微球菌屬(Micrococcus spp.)、第Ⅸ組為氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)、第Ⅹ組為不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)。

表1 細菌的形態特征及生理生化特性Table 1 The morphological characteristics and physiological-biochemical characteristic of bacteria

2.3 南美白對蝦冷藏過程中的菌相變化

將南美白對蝦經去頭等預處理后在(4±1)℃條件下冷藏，分別對冷藏初期(第0天)、高品質期(第2天)和貨架期終點(第4天)的細菌進行分離和鑒定。由細菌的形態特征結合生理生化實驗分析得到南美白對蝦冷藏過程中的菌相變化，其結果如表2所示。

表2 南美白對蝦冷藏過程中的菌相變化Table 2 Bacterial flora change in Penaeus vanmamei during refrigerated storage

由表2可見，在南美白對蝦的冷藏過程中革蘭氏陰性菌占有絕對優勢，冷藏初期分離獲得的10個屬的細菌中，有6個屬為G－，其數量占細菌總數的80%，且以黃桿菌的數量最多，占細菌總數的33.3%，其次是氣單胞菌，百分含量為13.3%，不動桿菌和假單胞菌占有10%的相同比例;冷藏至第2天，此時的對蝦為高品質期，G－的數量增長至86.7%，仍以黃桿菌(30%)的數量最多，不動桿菌由10%增長到16.7%，氣單胞菌和假單胞菌均占細菌總數的13.3%;隨著冷藏時間的延長，細菌種類逐漸減少，貨架期終點只分離到8個屬的細菌，其中G－占93.4%，氣單胞菌和假單胞菌均增加到16.7%，而黃桿菌減少為26.7%，其他種類的G－均有不同程度的增長。貨架期內希瓦氏菌的數量增長緩慢，僅由6.7%增加到10.0%，不動桿菌和腸桿菌的數量較穩定，均占細菌總數的10.0%左右，這與曹榮［11］及趙海鵬［13］等的研究結果存在差異，可能是養殖環境不同導致的初始細菌組成不同所致。

2.4 南美白對蝦優勢腐敗菌的初步鑒定

當南美白對蝦冷藏至第6天時，蝦肉腐敗變質不可食用，在此狀態下我們共分離得到87株細菌，按細菌形態特征結合文獻［6］進行分類鑒定后發現優勢菌有4個屬，其各自所占的比例見表3。

表3 南美白對蝦冷藏時優勢腐敗菌的組成Table 3 The composition of dominated spoilage organisms in Penaeus vannammei

從表3可知，4個屬的優勢腐敗菌均為革蘭氏陰性菌，它們占細菌總數的93.11%，分別是黃桿菌(28.74%)、氣單胞菌(16.09%)、假單胞菌(21.84%)和希瓦氏菌(26.44%)。南美白對蝦冷藏時腐敗變質主要是由這4個屬細菌的分解代謝造成的，黃桿菌對蛋白質有很強的水解能力，它使蝦肉在短時間內失去食用價值。氣單胞菌與其他腐敗菌協同作用，也能水解蛋白質、淀粉和脂肪等，并且產生的尸胺是腐敗時不良氣味的直接來源［14］。同時，氣單胞菌和希瓦氏菌能分解氧化三甲胺(TMAO)生成三甲胺(TMA)，使對蝦逐漸失去鮮味而變為難聞的臭魚腥味。假單胞菌和希瓦氏菌的代謝作用能使蝦肉發粘、變色，并產生氨和H2S等而散發出刺鼻的臭味［15］，使蝦肉在感官上難以接受。從腐敗的南美白對蝦蝦肉中分離獲得的優勢菌中，假單胞菌和希瓦氏菌所占比例較高，這與Gill等［16］的研究結果相似，認為假單胞菌和希瓦氏菌的存在是冷鏈流通中高蛋白水產品腐敗的主要原因。

3 結論與討論

3.1 結論

(1)湛江地區養殖的南美白對蝦在4±1℃的冷藏過程中，G－的數量由80.0%增長到93.4%，冷藏初期以黃桿菌和氣單胞菌數量最多，其次是不動桿菌和假單胞菌;高品質期黃桿菌和不動桿菌占優勢，其次是氣單胞菌和假單胞菌;貨架期結束時，黃桿菌、氣單胞菌和假單胞菌所占比例較大。

(2)南美白對蝦在(4±1)℃條件下冷藏至第6天，細菌總數高達2.4×107CFU/g，感官評分僅為4分，蝦肉完全腐敗變質，不能食用。此時從蝦肉中分離得到4個屬的優勢腐敗菌，它們均為革蘭氏陰性菌，分別是黃桿菌、希瓦氏菌、假單胞菌和氣單胞菌，共占細菌總數的93.11%，它們是導致南美白對蝦冷藏時腐敗的根本原因。

3.2 討論

本研究分析的對蝦的細菌菌相反映了湛江東海養殖環境下的南美白對蝦的細菌組成，當然，細菌的種類和數量還受到季節、捕撈方式等因素的影響［17］。目前，關于魚、蝦的菌相分析的研究并不少見［18］，但是有關湛江地區的養殖蝦的細菌組成的研究還甚少。雖然不同地區的南美白對蝦初始含菌量相差并不明顯，但是其細菌組成卻有較大的差異，導致保藏過程中呈優勢生長并對腐敗起主要作用的細菌的組成也有所不同。

以食品保藏為目的的細菌鑒定到屬就已經足夠了，目前，關于細菌鑒定的方法有多種，并且日益精確、方便和快捷，傳統的通過細胞形態和習性的觀察只能對細菌進行初步鑒定。隨著分子生物學的發展，以肽聚糖為基礎的細胞化學成分的分析、以蛋白質為基礎的蛋白質水平的鑒定和以核酸為基礎的核酸水平的鑒定都使細菌分類更加快速、準確。目前，國內外關于特定腐敗菌的研究已比較深入，多數學者認為耐冷的假單胞菌和希瓦氏菌是對蝦冷藏過程中的特定腐敗菌，本研究發現，湛江的養殖環境使南美白對蝦的優勢腐敗菌變為黃桿菌和希瓦氏菌，其次是假單胞菌和氣單胞菌，它們占了細菌總數的90%以上，是腐敗的直接原因。

對對蝦冷藏時的細菌菌相和優勢腐敗菌進行分析，可以為靶向抑菌的保鮮方法的開發提供數據支持，還可以為優勢腐敗菌生長動力學模型的構建和產品鮮度以及貨架期的預測提供理論依據。

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