液相色譜串聯質譜法測定煙草中的游離氨基酸

馬 戎，鮑峰偉，馮文寧，解 民，張艷芳，陳偉華

（河北中煙工業有限責任公司技術中心，河北 石家莊 050035）

0 引 言

氨基酸是煙草中一類重要化學物質，游離氨基酸與還原糖之間可以發生酶及非酶催化的棕色化反應，生成多種具有烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯等雜環化合物。現已經從煙草中分離得到的多種游離氨基酸主要可分為：芳香氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸），脂肪氨基酸（如天門冬氨酸、谷氨酸），雜環氨基酸（如脯氨酸、色氨酸）。這些眾多的氨基酸在煙草生長和加工的不同階段會發生不同的變化，適量的氨基酸有助于提高煙氣勁頭和增加豐滿度。若氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強烈，這是由于在燃燒過程中氨基酸通常生成NH3等含氮化合物，個別氨基酸還產生HCN等危害健康的煙氣成分；若氨基酸含量太低，煙氣則平淡無味缺少豐滿度[1]。因此對不同時期氨基酸含量及其變化情況的分析，可以為卷煙配方、煙葉加料、調制、發酵程度等提供理論指導。

目前，煙草中氨基酸的測定一般采用液相色譜法[2-5]或氨基酸分析儀法[6-7]，但由于氨基酸本身不具備紫外或熒光吸收，用以上兩種方法均需要衍生化操作，從而帶來衍生效率、衍生副產物以及反應產物穩定性等問題；因此，本文采用液質聯用技術對煙草中游離氨基酸進行了測定，避免了衍生化步驟帶來各種問題。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀、Agilent 6430三重四級桿質譜、KQ-500型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）、Elix Milli-Q超純水機（MILLIPORE SAS）、AB204-S型電子天平（METTLER TOLEDO）、LG10-2.4高速離心機（北京醫用離心機廠）。

甲酸（色譜純）、鹽酸（優級純）、乙腈（色譜純）、液氮、高純氮氣。20種氨基酸標準品。

1.2 LC-MS條件

色譜條件：色譜柱為XTerra MS C18（50mm×2.1mm×2.5μm）；進樣量為 5μL；柱溫為25℃；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；洗脫條件為 A∶B=95∶5，流速 0.5mL/min。

質譜條件：載氣壓力為0.6MPa；離子源溫度為350℃；載氣流量10 L/min；碰撞氣壓力為0.15MPa；電離方式為ESI；極性為正模式；掃描模式為多反應監測（MRM）；采集時間為30min；毛細管溫度為350℃；碰撞氣壓力為0.15MPa；各化合物的母離子、解離電壓、子離子以及碰撞能量（CE）參見表1；其他參數由自動調諧確定。

表1 各氨基酸的質譜檢測參數

1.3 標準溶液

用0.1%的鹽酸溶液配制成各氨基酸濃度為0.1，0.5，2.5，10，50μg/mL 的系列混合標準溶液。

1.4 樣品處理

按YC/T 31制備試樣，準確稱取0.5 g試樣于50mL三角瓶中，加入20mL 0.1%的鹽酸溶液，超聲萃取15min，將萃取液轉入10mL離心管中，10000 r/min離心5min，取上清液過0.22μm水相濾膜，待測。

2 討 論

2.1 萃取溶劑的確定

根據相關文獻，植物樣品中游離氨基酸的萃取溶劑主要有1%鹽酸、0.1%鹽酸、80℃蒸餾水、80%乙醇等，其中最常用的是0.1%的鹽酸溶液和80%的乙醇溶液。用上述兩種溶液對同一樣品分別萃取6次，結果如表2所示。

表2 不同種類萃取溶液的萃取效果

由表2可見，除Trp、Arg外，鹽酸萃取液測得的數值都高于乙醇；除Asn、Tyr、Lys外，鹽酸萃取液的變異系數小于乙醇。因此，認為鹽酸溶液的萃取效果優于乙醇溶液。分別試驗了0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1%6個濃度的鹽酸溶液的萃取效果如圖1所示。0.1%的鹽酸對大多數氨基酸的萃取效果優于其他濃度的鹽酸。因此，選擇0.1%的鹽酸為萃取劑。

2.2 稱樣量的選擇

為考察樣品量對實驗檢測結果的影響，試驗了5個樣品量，加入50mL萃取劑，每個樣品量重復6次，結果如表3所示。隨著稱樣量增加，測定結果的相對標準偏差逐漸減小，但0.5 g以后變化不大，且樣品溶液逐漸混濁，給后續操作帶來不便。因此，確定0.5g為稱樣量。

2.3 工作曲線、重復性與回收率

將5個不同濃度的混合氨基酸標準溶液分別進行檢測，用各氨基酸的峰面積對應其相應的濃度進行回歸分析，得到回歸方程及其相關系數見表4，標準樣品色譜圖如圖2所示。將最低濃度的標準溶液平行測定6次，所得測定結果信噪比的3倍即為定性檢出限，信噪比的10倍為定量檢出限。表5分別列出了20種氨基酸的定量檢出限和定性檢出限。結果表明：在樣品中氨基酸的含量范圍內，響應值與對應的各氨基酸的濃度呈良好的線性關系。采用標準加入法，用最優的前處理條件提取加標樣品中的游離氨基酸，測定樣品溶液中各氨基酸的回收率見表5，樣品溶液中20種氨基酸的回收率均在86.4%～105.9%之間。

圖1 鹽酸溶液對檢測結果的影響

表3 稱樣量的選擇

2.4 實際樣品測定

表4 氨基酸測定的標準曲線和相關系數

圖2 氨基酸標樣多反應監測譜圖

表5 方法的回收率、檢出限和定量限

選取3個烤煙煙葉、1個白肋煙煙葉和1個成品卷煙檢測氨基酸含量，結果見表6。數據表明烤煙的Met、Gln明顯高于白肋煙，白肋煙的Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Val、Ile、Lys、Arg 明顯高于烤煙，檢測樣品中Asn的含量顯著高于其他氨基酸，白肋煙20種氨基酸總量高于烤煙。

表6 實際樣品檢測結果

3 結束語

建立了液相色譜質譜聯用測定煙草與煙草制品中游離氨基酸的方法，該方法操作簡單，不需對樣品進行衍生化處理，檢測結果的平均回收率為86.4%～105.9%，檢出限為 0.001～0.011μg/mL，綜上，該方法準確、快捷、選擇性好，具有較強的實用價值。

[1]閆克玉.煙草化學[M].鄭州：鄭州大學出版社，2002：57-67.

[2]馮雷，陳章玉，王保興，等.柱前衍生化反相高效液相色譜法測定煙草中的游離氨基酸[J].云南大學學報：自然科學版，2003（S1）：241-245.

[3]景延秋，高玉珍，魯平，等.反相高效液相色譜法在測定白肋煙煙葉游離氨基酸含量中的應用 [J].河南農業大學學報，2007（5）：502-505.

[4]李丹，黃龍，朱巍，等.反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸[J].煙草科技，2003（2）：20-24.

[5]程勇，陳玲，鄧曉春.柱前衍生HPLC法測定煙葉中20種游離氨基酸含量[J].煙草科技，2010（8）：34-40.

[6]YC/T 282—2009煙葉.游離氨基酸的測定.氨基酸分析儀法[S].

[7]張峻松，賈春曉，李炎強，等.煙草中游離氨基酸的自動分析儀測定[J].煙草科技，2004（8）：26-32.