乳糖酶水解生產(chǎn)低乳糖牛乳工藝的優(yōu)化

王曉哲 錢 方 曹 迪 牟光慶 姜淑娟

WANG Xiao-zhe QIAN Fang CAO Di MU Guang-qingJIANG Shu-juan

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

(College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China)

牛乳含有能促進(jìn)人類生長(zhǎng)發(fā)育以及維持健康水平的必需營(yíng)養(yǎng)成分，是一種重要的飲食資源[1]。但由于牛乳中乳糖不易被消化、吸收，極易引發(fā)乳糖不耐受現(xiàn)象。部分人群存在乳糖不耐癥，是由于體內(nèi)缺乏乳糖酶，食用乳或乳制品后會(huì)引發(fā)腸脹、排氣增多、腹瀉、腹痛等非疾病性胃腸癥狀。據(jù)調(diào)查，亞洲人口中約有70%人群患有不同程度的乳糖不耐癥，在美國(guó)也有1/3人群體內(nèi)乳糖酶水平較低。研究[2，3]顯示中國(guó)成年人飲用牛奶后乳糖不吸收的發(fā)病率高達(dá)86.7%，不耐受指數(shù)為0.9。生產(chǎn)提供低乳糖乳是解決乳糖不耐問(wèn)題的有效途徑。低乳糖乳在國(guó)外已商業(yè)化生產(chǎn)，在中國(guó)則剛起步。低乳糖乳的生產(chǎn)方式有多種，其中酶水解法生產(chǎn)是最具安全性、實(shí)用、有效的方法，且生產(chǎn)成本低，對(duì)拓展低乳糖乳的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有著很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[4-6]。通常低乳糖乳中乳糖水解率可達(dá)到70%～90%，是乳糖不耐受患者的最佳食品。它既能滿足該人群的營(yíng)養(yǎng)需求，又能消除他們飲用牛乳后所產(chǎn)生的不適癥狀[7]。另外，由于低乳糖牛乳中乳糖酶解產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖兩種單糖，雖牛乳甜度增加，但總糖量并不改變，這樣便可解除乳糖不耐癥患者不能喝牛乳的苦惱。所以，低乳糖牛乳是集營(yíng)養(yǎng)和美味于一身的健康食品，滿足了這部分人群的乳品消費(fèi)的需求[8]。本試驗(yàn)擬設(shè)計(jì)合理的低乳糖牛乳生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步確定其最佳酶解條件，使乳糖達(dá)到最大限度水解。

1 材料與儀器

1.1 材料

純牛奶：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司；

醋酸鉛：天津市津科精細(xì)化工研究所；

ONP（鄰硝基酚）：分析純，沈陽(yáng)市試劑三廠；

ONPG（鄰硝基苯酚-β-D半乳糖苷）：光學(xué)純，美國(guó)Solarbin公司；

乳糖酶：592.20 U/mL，丹麥Novozymes公司。

1.2 儀器

光柵分光光度計(jì)：722型，山東高密彩虹分析儀器有限公司；

數(shù)控超級(jí)恒溫槽：SC-15型，寧波天恒儀器廠；

手提式不銹鋼高壓殺菌器：YX280A型，上海驚鴻實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：PL303型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低乳糖牛乳的工藝流程

原料乳驗(yàn)收→預(yù)處理→標(biāo)準(zhǔn)化→巴氏殺菌 (65℃，30 m in)→冷卻→添加乳糖酶→水解→滅酶殺菌→灌裝→成品[9,10]

1.3.2 乳糖酶活力測(cè)定 采用ONPG法[11]。

1.3.3 乳糖量及水解度測(cè)定 采用碘量法[12]。

1.3.4 單因素分析乳糖酶的適宜水解條件

(1)適宜水解溫度的確定：將牛乳和適當(dāng)酶液分別在30，35，40，45，50 ℃下預(yù)熱 10min，控制乳糖酶量 2 000 U/L，水解0.5 h后滅酶，通過(guò)測(cè)定乳糖水解率（平行2次）確定乳糖酶的適宜水解溫度。

(2)適宜加酶量的確定：水解溫度采用1.3.4(1)中確定的適宜水解溫度。分別以終濃度 500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/L添加乳糖酶液，水解0.5 h后滅酶，通過(guò)測(cè)定乳糖水解率（平行2次）確定乳糖酶的適宜加酶量。

(3)適宜水解時(shí)間的確定：水解溫度和加酶量采用1.3.4(1)和(2)中確定的適宜值，分別水解牛乳 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h后滅酶，通過(guò)測(cè)定乳糖水解率（平行2次）確定乳糖酶的適宜水解時(shí)間[13，14]。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化乳糖酶水解條件 考慮到乳糖酶不同水解因素間的交互作用，設(shè)計(jì)L9（34）正交表，以乳糖酶水解率為指標(biāo)，考察水解溫度、水解時(shí)間和加酶量3因素（分別以A、B、C表示）對(duì)乳糖酶效果的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素分析乳糖酶的適宜水解條件

2.1.1 水解溫度的確定 由圖1可知，酶解溫度在30～40℃時(shí)，乳糖水解率隨著酶解溫度的增加而增大，當(dāng)酶解溫度達(dá)到40℃時(shí)，水解率達(dá)到最大值；在40～50℃時(shí)，隨著酶解溫度的增加，水解率反而下降。這是因?yàn)椋附鉁囟冗^(guò)高時(shí)，乳糖酶穩(wěn)定性較差并且已部分失去活性，不能充分的水解乳糖。因此確定乳糖酶酶解的最適溫度為40℃。

圖1 溫度對(duì)乳糖水解的影響Figure 1 Effects of different temperature on lactose hydrolysis

2.1.2 加酶量的確定 由圖2可知，當(dāng)加酶量為500～2 500U/L時(shí)，乳糖水解率隨著加酶量的增大而逐漸增大，當(dāng)加酶量繼續(xù)增大時(shí)，水解率變化很小且趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)榕Ｈ橹腥樘请S著乳糖酶量的增加，由原來(lái)的過(guò)量逐漸達(dá)到飽和。因此，選擇2 500 U/L為最適加酶量，此時(shí)乳糖水解率為32.14%。

圖2 加酶量對(duì)乳糖水解率的影響Figure 2 Effects of differentenzyme dosage on t lactose hydrolysis

2.1.3 水解時(shí)間的確定 由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，低乳糖牛乳中乳糖的水解率也隨之增大；酶解0.5～2.5 h時(shí)，水解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；酶解2.5 h時(shí)，水解率達(dá)到65.71%。考慮到產(chǎn)品在酶解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程的污染，從而影響低乳糖牛乳的產(chǎn)品質(zhì)量。因此，確定乳糖酶的最適酶解時(shí)間為2.5 h。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)乳糖水解的影響Figure3 Effectsofdifferentenzymolysis time on lactosehydrolysis

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化乳糖酶水解條件

考慮到乳糖酶不同水解因素間的交互作用，采用三因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，來(lái)優(yōu)化低乳糖牛乳中乳糖的最佳水解條件。正交試驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果分析（表2）可以看出最優(yōu)組合為A2B2C3，即水解溫度40℃、水解時(shí)間3 h、加酶量2 500 U/L。這時(shí)牛乳中的乳糖水解率最高，達(dá)到75.00%。通過(guò)正交試驗(yàn)極差比較可以看出，低乳糖牛乳中乳糖酶水解因素對(duì)水解率的影響效果大小為A＞B＞C，即水解溫度＞加酶量＞水解時(shí)間。

表1 乳糖酶水解牛乳的因素水平表Table1 Factor level tableof lactoseenzymehydrolysismilk

表2 乳糖酶水解牛乳正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果分析Table2 L9(34)orthogonal test resultanalysis of lactose enzyme hydrolysis

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3），并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。可知，F(xiàn)A＞FB＞FC。而且 FA＞F0.01(2,2)，這說(shuō)明對(duì)于低乳糖牛乳中乳糖水解率來(lái)說(shuō)，水解溫度為極其顯著因素；而F0.05(2,2)＜FB＜F0.01(2,2)，說(shuō)明加酶量為一般顯著因素，F(xiàn)C＜F0.05(2,2)，說(shuō)明在上述水解時(shí)間內(nèi)，水解時(shí)間對(duì)水解度沒(méi)有顯著性影響，可選取較短酶解時(shí)間。

進(jìn)一步對(duì)上述正交優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別在水解時(shí)間為2 h和3 h時(shí)測(cè)定低乳糖牛乳中乳糖的水解率，結(jié)果分別是74.50%和75.00%，水解率的增幅不是很大，考慮到實(shí)際生產(chǎn)，為縮短生產(chǎn)時(shí)間、降低成本和避免染菌，試驗(yàn)選取水解時(shí)間為2 h，此時(shí)水解率為74.50%。因此，確定最優(yōu)工藝條件為水解溫度40℃、加酶量2 500 U/L、水解時(shí)間2 h。

表3 乳糖酶水解牛乳正交試驗(yàn)L9（34）方差分析表Table3 Orthogonal test L9(34)analysis of variance table of lactose enzyme hydrolysismilk

3 結(jié)論

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了低乳糖牛乳的生產(chǎn)工藝，并通過(guò)單因素分析和正交試驗(yàn)研究確定了牛乳的最佳水解條件：在加酶量2 500 U/L、水解溫度40℃、水解2 h時(shí)牛乳中乳糖水解效果最佳，水解率達(dá)到74.50%。此研究解決了乳糖不耐癥患者不能喝牛乳的苦惱，而且在乳糖酶解過(guò)程中也產(chǎn)生了單糖[15]，增加了牛乳的甜度。

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