ROL酶解制備富含甘油二酯的大豆油工藝的優(yōu)化

張夢柯 石 波 李 穎 李 超 左劍南 程永強(qiáng)

ZHANGMeng-ke1 SHIBo2 LI Ying3 LIChao1 ZUO Jian-nan1 CHENG Yong-qiang1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100083）

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100081,China;3.College of Biological Sciences,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是甘油三酯（triacylglycerol，TAG）中一個脂肪酸被羥基所取代的結(jié)構(gòu)脂質(zhì),有1,2-DAG和1,3-DAG兩種同分異構(gòu)體[1]。DAG是油脂的天然組成成分，但含量很低，通常不超過10%[2]。DAG與TAG具有相似的口感、色澤、風(fēng)味、質(zhì)地和能量值（DAG為38.9 kJ/g，TAG為39.6 kJ/g）[3,4]。研究表明，不飽和脂肪酸型的甘油二酯具有抑制脂肪在動物和人體內(nèi)積累的功能[5-7]，這主要是因?yàn)镈AG，尤其是1,3-DAG，在小腸內(nèi)不能降解為 2-單甘酯（monoglyceride，MAG），這些生理差異使甘油二酯的餐后血脂降低，體內(nèi)脂肪酸氧化速率加快[8]。甘油二酯的這些功能和特點(diǎn)使其作為一種安全健康的食用油[9]，在日本及美國的市場上深受廣大消費(fèi)者的歡迎。

近年來，中國在甘油二酯的生產(chǎn)工藝上進(jìn)行了一些研究，主要有化學(xué)合成法，生物酶合成法（包括油脂水解法、油脂醇解法、直接酯化法和油脂甘油解法）和微生物發(fā)酵法[10]，其中利用脂肪酶催化生產(chǎn)甘油二酯，具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)得率高、產(chǎn)品品質(zhì)高、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn),是最具應(yīng)用前景的生產(chǎn)工藝。然而脂肪酶催化水解制備甘油二酯的文獻(xiàn)報(bào)道并不多，因此本試驗(yàn)以大豆油為材料，對3種不同脂肪酶進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，并進(jìn)一步對其中最優(yōu)的脂肪酶催化水解制備富含甘油二酯的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為實(shí)現(xiàn)甘油二酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的研究基礎(chǔ)和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆油：福臨門大豆油，市售；

RML、ROL和ALIP脂肪酶：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院提供；

1，3-二亞油酸甘油酯標(biāo)樣：美國Sigma公司

乙腈、異丙醇、甲酸：色譜純，美國Fisher公司；

1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備

分析天平：AR2140型，美國奧豪斯公司；

磁力攪拌器：RTC basic型，德國IKA公司；

示差折光檢測器：2944型，美國Waters公司；

高壓輸液泵：2695型，美國Waters公司；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZHWY-200D型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

色譜柱：Sunchrom ODSC18（4.6mm×250mm，5μm）型，北京金歐亞有限公司；

高速離心機(jī)：HC-2518型，科大創(chuàng)新股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理 稱取2.5 g大豆油于 50 mL的錐形瓶中，并將其置于恒溫培養(yǎng)箱中，預(yù)熱至設(shè)定溫度后，加入一定量的酶液和水，用恒溫培養(yǎng)振蕩器在一定的攪拌速度下，反應(yīng)一定的時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液沸水滅活10min，冷卻后離心10min，取上清液進(jìn)行分析。

1.3.2 分析方法

(1)樣品前處理：從大豆油原料及上述反應(yīng)產(chǎn)物中的上清液里取少量樣品，用流動相溶解樣品配制濃度為10mg/mL。取1.5mL過0.45μm有機(jī)膜于進(jìn)樣瓶中。

(2)甘油二酯的組成測定：采用高效液相（HPLC）測定。檢測條件：乙腈—異丙醇（70/30，V/V）流動相等度洗脫；流動相流速為1.0 mL/min；檢測器溫度30℃；柱溫30℃；樣品進(jìn)樣量20μL；示差檢測器檢測；面積歸一化法定量。因?yàn)榇蠖褂兔附夂螽a(chǎn)物中甘油二酯是混合物，成分比較復(fù)雜，其中還包括DAG的異構(gòu)體，所以不可能通過商業(yè)渠道購買所有DAG的標(biāo)準(zhǔn)樣品用來確定產(chǎn)物中每一種DAG的含量[11]。大豆油中甘油三酯主要是 LLL，LLO，LLP，OLO 和 PLO[12]，理論上講，甘油二酯產(chǎn)物中二亞油酸甘油酯的含量應(yīng)該相對較多，故本試驗(yàn)用酶解產(chǎn)物中1，3-亞油酸甘油酯作為定量分析酶解產(chǎn)物中甘油二酯含量的一個指標(biāo)。

(3)數(shù)據(jù)處理：每個條件做3次平行試驗(yàn)，取平均值進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1)不同酶催化下反應(yīng)時(shí)間對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響：在溫度35℃、含水量28.57%、加酶量20 U/g、攪拌速度150 r/min的條件下，以酶解產(chǎn)物中1，3-二亞油酸甘油酯為衡量指標(biāo)，考察不同脂肪酶催化下大豆油酶解反應(yīng)情況。

(2)反應(yīng)溫度對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響：在時(shí)間4 h、含水量 28.57%、加酶量64 U/g、攪拌速度150 r/min的條件下，考察溫度對酶催化水解反應(yīng)效率的影響。

(3)加酶量對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響：在溫度30℃、時(shí)間4 h、含水量 70.59%、攪拌速度150 r/min的條件下，考察加酶量對酶催化水解反應(yīng)效率的影響。

(4)含水量對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響：在溫度30℃、時(shí)間4 h、加酶量64 U/g、攪拌速度150 r/min的條件下，考察含水量對酶催化水解反應(yīng)效率的影響。

(5)攪拌方式及轉(zhuǎn)速對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響：在溫度30℃、時(shí)間4 h、加酶量64 U/g、含水量28.57%的條件下，考察不同攪拌速度對酶催化大豆油水解效率的影響，同時(shí)對比了恒溫振蕩箱和磁力攪拌器兩種攪拌方式對反應(yīng)效率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)用酶的篩選

采用脂肪酶（RML，ROL和ALIP），分別測定了在不同酶的催化下生成的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨催化時(shí)間的變化，其結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶催化下反應(yīng)時(shí)間對酶解反應(yīng)效果的影響Figure 1 Influence of reaction time on enzymatic hydrolysis of different lipases

由圖1可知，ALIP催化大豆油產(chǎn)生甘油二酯的能力最低，其主要原因可能是該酶無1，3位催化特異性。RML和ROL雖然都是1，3位特異性催化酶，但ROL的催化活性更高，其產(chǎn)物中1，3-二亞油酸甘油酯含量高達(dá)16%以上，且經(jīng)4 h反應(yīng)就基本達(dá)到平衡，所以后續(xù)研究選用ROL為試驗(yàn)用酶，反應(yīng)4 h最佳。

2.2 反應(yīng)溫度對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，測定了水解產(chǎn)生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨反應(yīng)溫度的變化，其結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶催化水解大豆油的反應(yīng)效率在 25～45℃的溫度范圍內(nèi)幾乎沒有太大變化。這說明ROL在一定范圍內(nèi)對溫度的變化不敏感。在反應(yīng)溫度上升到50℃之后，酶的催化效率隨著溫度的升高而迅速降低，到60℃時(shí)，酶的催化活性已經(jīng)很低了。這是因?yàn)橐欢ǚ秶鷥?nèi)溫度的增加可以減少混合物的黏度，提高溶解度和改善底物的擴(kuò)散過程，從而減少傳質(zhì)的限制，有利于酶與底物之間的相互作用[13]；然而由于酶是具有生物活性的大分子物質(zhì)，過高的溫度會使酶催化中心的空間構(gòu)象發(fā)生了不可逆的變化，酶的催化活性降低甚至失活。從實(shí)際生產(chǎn)的角度考慮，反應(yīng)溫度取30℃最為適宜。

圖2 溫度對酶解反應(yīng)效果的影響Figure 2 Influence of reaction time on enzymatic hydrolysis

2.3 加酶量對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，測定了水解產(chǎn)生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨加酶量的變化，其結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對酶解反應(yīng)效果的影響Figure 3 Influence of enzyme load on enzymatic hydrolysis

由圖3可知，隨著酶量的增加，酶的催化效率逐漸提高，但當(dāng)加酶量超過64 U/g時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物中甘油二酯的含量幾乎不再變化。這主要是因?yàn)樵谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)，酶濃度的增加使反應(yīng)體系中的酶分子有更多的活性部位與底物接觸，反應(yīng)效率提高；但是當(dāng)酶活性部位過量時(shí)，將有可能由于蛋白的聚集作用而不再與底物接觸[14]，從而不能繼續(xù)加快反應(yīng)速率。在加酶量為64 U/g時(shí)，反應(yīng)達(dá)到飽和，反應(yīng)體系處于平衡狀態(tài)。故加酶量64 U/g為最佳。

2.4 含水量對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，測定了水解產(chǎn)生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨反應(yīng)體系中含水量的變化，其結(jié)果見圖4。

脂肪酶是在油水界面上發(fā)揮催化作用的酶，水是維持酶活性的必備條件，含水量過低，則會影響酶分子表面的單分子層，使酶分子的構(gòu)象和活性受到影響[15]，所以含水量是一個重要的影響因素。由圖4可知，隨著含水量的增加，酶解產(chǎn)物中甘油二酯的含量逐漸降低。這主要是因?yàn)槊复偎怏w系中液體酶中的水已經(jīng)滿足酶的催化作用，多余的水打破了水—油界面的平衡，隨著水界面的增大,酶分子與油界面的接觸機(jī)會減少，催化效率下降。故后續(xù)試驗(yàn)中不再向反應(yīng)體系額外添加水。

圖4 含水量對酶解反應(yīng)效果的影響Figure 4 Influence ofwater content on enzymatic hydrolysis

2.5 攪拌方式及轉(zhuǎn)速對酶催化水解產(chǎn)生甘油二酯含量的影響

以ROL為催化劑，分別測定了不同攪拌方式下水解產(chǎn)生的1，3-二亞油酸甘油酯的含量隨攪拌速度的變化，其結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 恒溫振蕩箱振蕩速度對酶解反應(yīng)效果的影響Figure 5 Influence of constant temperature vibrator agitation speed on enzymatic hydrolysis

圖6 磁力攪拌器轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速對酶解反應(yīng)效果的影響Figure 6 Influence ofmagnetic stirrer agitation speed on enzymatic hydrolysis

由圖5和圖6可知，在一定范圍內(nèi)，隨著攪拌速度的增大，酶催化反應(yīng)效率提高。這是因?yàn)閿嚢杷俣鹊脑龃螅黾恿嗣概c水—油反應(yīng)界面的接觸面積，從而提高了酶的催化效率。但隨著攪拌速度的進(jìn)一步增大，反應(yīng)效率反而降低，這可能是因?yàn)椋孩倜概c反應(yīng)界面的充分接觸，促使酶進(jìn)一步催化甘油二酯水解為單甘脂和游離脂肪酸，從而使體系中甘油二酯的含量降低；②過高的轉(zhuǎn)速使轉(zhuǎn)子在攪拌過程中產(chǎn)生的不良剪切效應(yīng)破壞了酶分子的空間構(gòu)象，使其催化活性降低[16]。兩種不同攪拌方式的結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，振蕩箱進(jìn)行攪拌時(shí)，1，3-二亞油酸甘油酯的含量不高，為16.96%。磁力攪拌要明顯優(yōu)于恒溫振蕩箱攪拌，1，3-亞油酸甘油酯的含量為23.91%，提高了9.65%。這主要是因?yàn)榇帕嚢杵鬓D(zhuǎn)子產(chǎn)生的剪切力使底物與酶的接觸更加均勻充分，從而提高了酶的催化效率。故選用磁力攪拌的方式，攪拌速度為500 r/min最佳。

根據(jù)HPLC-RID對最優(yōu)條件下甘油二酯中各組分的檢測，通過不帶校正因子的面積歸一化法[17]算出甘油二酯的含量高達(dá)55.5%。馬傳國等[18]利用Novozym435酶，在6.5 h，85℃下甘油二酯的得率為50.44%，與此相比，ROL用時(shí)更短，溫度要求相對溫和，得率也相對更高，更具有實(shí)現(xiàn)甘油二酯商業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

3 結(jié)論

(1)選用脂肪酶ROL催化大豆油水解產(chǎn)生甘油二酯，2.5 g大豆油中加入64 U/g ROL酶液，在磁力攪拌器的轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為500 r/min，反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為4 h的條件下，產(chǎn)物中1,3-二亞油酸甘油酯含量最高，為23.91%。

(2)該方法得到的產(chǎn)物中除了高含量的甘油二酯之外，還伴隨有游離脂肪酸和單甘酯的生成，這些物質(zhì)的存在會影響富含甘油二酯的大豆油的穩(wěn)定性，如何在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步促使這些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甘油二酯，是接下來的研究方向和重點(diǎn)。

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