肉制品中3,4-苯并（α）芘檢測方法的改進

曾習文 李 宏 夏立新 彭新凱 楊彥寧 黎 瑛

ZENG Xi-Wen1 LIHong2 XIA Li-Xin1 PENG Xin-Kai1 Y ANG Yan-Lin1 LIYing1

（1.長沙市食品質量安全監督檢測中心，湖南 長沙 410013；2.北京東方凱姆質量認證中心，北京 100021）

(1.Changsha Center of Supervision and Inspecetion on Food Quality Safety,Changsha,Hunan 410013,China;2.Beijing CAM Quality Certification Center,Chaoyang District,Beijing 100021,China)

3 ,4-苯并（α）芘又稱苯并芘（benzopyrene），是一種由5個苯環構成的多環芳烴，其性質穩定，不溶于水，溶于苯、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，是一種很強的致癌物質，可誘變皮膚、肺和消化道癌癥[1-3]，并有一定的致畸作用[4]。

熏燒烤肉深受消費者喜愛，但在煙熏、燒烤、油炸肉制品過程中，會產生致癌物質3,4-苯并(α)芘[5,6]。現有檢測方法主要有高效液相色譜—熒光檢測器法[7-9]，氣相色譜—質譜法[10-12]，氣相色譜—高分辨質譜法[13]，紫外分光光度法[14]，但其前處理都存在不同程度的缺陷，以致在實際工作中很難開展。

胡奇杰等[6]采用正己烷提取結合C18小柱固相萃取凈化法對肉制品進行前處理，這種方法的優點在于對樣品凈化時不需要繁瑣的操作，但使用了比較昂貴的C18固相萃取小柱，使得檢測成本顯著上升；中國NY/T 1666——2008中采用環己烷提取結合二甲亞砜—環己烷反提凈化法對肉制品進行前處理，這種方法不需要昂貴材料（C18固相萃取小柱），但是操作過程繁瑣，且可操作性很差，不利于對大量樣品進行同時處理。本試驗在前人的研究基礎上，改進了肉制品中苯并芘檢測的前處理方法，采用安全性更高的乙酸乙酯作為提取溶劑，通過提取、濃縮、再反提凈化的方法，結合高效液相色譜—熒光檢測器對肉制品中苯并芘殘留實現快捷有效的測定，大大節省了檢測時間及檢測成本，同時減少了對環境的污染，真正意義上實現了環境友好型檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甲醇、乙腈：色譜純，美國默克公司；

乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、石油醚、環己烷、正己烷、無水硫酸鈉、三氧化二鋁：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

苯并(α)芘標準品：10 μg/mL，國家標物中心。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（帶熒光檢測器）：LC-20AT型，島津公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

超聲波清洗機：SB-25-12DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

離心機：CT14D型，上海天美生化儀器設備工程有限公司；

氮吹儀：HGC-24A型，北京晨曦勇創科技有限公司；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

固相萃取小柱：C18型，美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 標準貯備液及標準使用溶液的配制 將1mL標準品（10μg/mL）加入到10mL棕色容量瓶中，甲醇定容得濃度為1μg/mL的標準貯備液（A液），0～5℃避光保存。分別吸取定量A液于10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成0.0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，100.0 ng/mL 標準使用溶液。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse PAH 4.6×250mm，5μm；流動相：A為超純水，B為色譜純乙腈；采用等度洗脫（乙腈∶水=90∶10），洗脫時間：20min；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進樣量：10μL；熒光檢測器激發波長為384 nm，檢測波長為406 nm；以色譜峰面積外標法定量。

1.3.3 樣品處理 取肉制品，切碎，攪拌機搗碎，稱取10 g左右樣品于50mL離心管中，加入2 g無水硫酸鈉，20mL乙酸乙酯，渦旋混勻1min，超聲提取10min，10 000 r/min離心3min，傾出上清液，20 mL乙酸乙酯重復提取1次，合并提取液，旋蒸濃縮至近干，5mL石油醚轉移濃縮液至10 mL比色管中，氮吹至干，加入2mL甲醇，渦旋1min，0.45μm尼龍濾膜過濾后上機測定。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

以往的文獻[6]和標準[15]中，提取溶劑都限于石油醚、環己烷、正己烷等極性很小的溶劑，雖然這些溶劑對苯并芘溶解性都很好，但對肉制品中苯并芘的提取能力如何還沒有人進行過考究。一種好的提取溶劑應該具備兩個特點：①對目標物要有良好的溶解性，②溶劑要具有對樣品良好的滲透能力。為了找到更加適合肉制品中苯并芘殘留提取的有機溶劑，對不同極性有機溶劑提取能力進行了比較。結果見表1。

不同溶劑提取效果試驗結果顯示，提取能力二氯甲烷最強，乙酸乙酯次之，這可能與二氯甲烷、乙酸乙酯強的滲透力（對樣品）及良好的溶解性（對目標物）有關。由于二氯甲烷毒性較大，對人體有很大危害且價格較乙酸乙酯昂貴，綜合考慮環保和經濟因素，最終選擇乙酸乙酯作為提取肉制品中苯并（α）芘的溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

取同一批次陰性肉制品，切碎，攪拌機搗碎，稱取樣品（10±0.01）g，5 個平行，3 種標樣添加水平（5，50，500 ng）。樣品置于50mL離心管中，加入2 g無水硫酸鈉，加入20mL乙酸乙酯，渦旋混勻1min，超聲提取10min，10 000 r/min離心3 min，傾出上清液，20 mL乙酸乙酯重復提取1次，合并提取液，旋蒸濃縮至近干，5mL石油醚轉移濃縮液至10mL比色管中，氮吹至干。分別選用C18小柱固相萃取法、甲醇反提法、乙腈反提法、中性氧化鋁過柱法、二甲亞砜—環己烷反提法5種方法分別對乙酸乙酯超聲提取濃縮物進行凈化處理，所得結果見表2。

表1 不同溶劑提取樣品中3,4-苯并(α)芘結果對比Table1 Resultsabout3,4-benzo(α)pyrene in sampleby different reagentextracting

表2 不同凈化方式結果對比Table2 Resultsweregiven by differentpurifyingmethod

試驗結果顯示：操作性方面，甲醇反提法與乙腈反提法占優勢，而C18小柱固相萃取法、中性氧化鋁過柱法[15]及二甲亞砜—環己烷反提法均需要復雜的處理過程，在對大量肉制品進行前處理時明顯不適應；回收率方面，用中性氧化鋁過柱法凈化時回收率最高（90.3%），甲醇反提法次之（87.7%），乙腈反提法（81.5%），二甲亞砜—環己烷反提法及C18小柱固相萃取法較差。中性氧化鋁過柱法操作繁瑣且需要使用大量溶劑，對環境會造成一定程度污染，同時成本也相對較高；而乙腈反提法回收率（81.5%）較甲醇反提法要低（87.7%），并且乙腈價格高于甲醇，對環境的污染也較大。綜合考慮成本及環境因素前提下，最終選擇甲醇反提法作為肉制品中苯并芘檢測的凈化方法。分析認為甲醇反提能達到凈化的目的與甲醇對油脂的溶解性不好，對目標化合物苯并芘有一定溶解性，且在油脂中的滲透性較好有關，也就為濃縮液凈化提供了方便。

2.3 檢測方法比對

為了得到一種簡便、快捷、經濟、環保的肉制品中苯并芘殘留量檢測方法，需要對現有報道方法[6,15]進行改進，并將改進后的方法與前人報道方法進行比對，所得結果見表3。

3 種方法測定肉制品中苯并芘含量時：胡奇杰等[6]采用正己烷提取結合C18小柱固相萃取凈化法對肉制品進行前處理，這種方法的優點在于對樣品凈化時不需要繁瑣的操作，但使用了比較昂貴的C18固相萃取小柱，使得檢測成本顯著上升，且回收率（73.0%）也不太理想，不適合大批量肉制品中苯并芘殘留量檢測的前處理；中國NY/T 1666——2008中采用環己烷提取結合二甲亞砜—環己烷反提凈化法對肉制品進行前處理好，這種方法不需要昂貴的材料(C18固相萃取小柱)，但操作過程繁瑣，且可操作性很差，回收率（67.5%）較低，不適于對大量樣品進行同時處理。本試驗采用乙酸乙酯超聲提取、旋蒸濃縮、甲醇反提凈化對肉制品進行前處理，其操作過程簡便，檢測成本低廉，對環境污染較小，且有很強的可行性（回收率達到87.7%）和很好的穩定性（RSD小于2.5%），很適合對大量肉制品同時進行前處理，能真正意義上實現肉制品中苯并芘殘留量的快速檢測。

2.4 回歸方程、檢出限、回收率、精密度

表3 不同檢測方法結果對比Table3 Resultsweregiven by differentdeterminingmethod

配制濃度為 0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，100.0 ng/mL的3,4-苯并(α)芘標準使用溶液，依次進樣，以所得峰面積為橫坐標（X），標準使用液濃度為縱坐標（Y）繪制標準工作曲線標準。試驗測得3,4-苯并(α)芘標準工作溶液在0.5～100 ng/mL濃度范圍內，其線性回歸方程為Y=4.095×10-5X-4.449×10-2，相關系數R=0.999 9，表明線性關系良好。

對空白樣品進行測定，以3倍信噪比作為方法檢出限，10倍信噪比作為方法定量限。肉制品中苯并芘的檢出限為0.15μg/kg，定量限為0.50μg/kg。以3種濃度添加水平重復測定5次，分別計算各種濃度添加水平回收率及精密度，檢驗方法的穩定性和可行性，所得結果見表4。

表4 不同濃度添加水平回收率及精密度Table4 Recovery and precision atdifferentddition levels

由表4可知，3種濃度添加水平的回收率都大于87%，保證了本試驗檢測方法的可行性；而精密度均小于2.4%則保證了結果的穩定性和準確性。

2.5 不同樣品的檢測

選取牛肉、豬肉、兔肉、雞肉、羊肉、魚肉、香腸、豬舌尖、豬臉，用本試驗報道方法檢測，每種樣品取5個平行，所得結果見表5。

表5 不同樣品檢測結果Table5 Determining resultsofdifferentsample

試驗結果表明，將本方法應用到不同肉制品中苯并芘進行前處理時，平行性非常好（RSD均小于2.5%），表明此方法穩定可靠，完全可以作為肉制品中苯并芘殘留量檢測的前處理方法。

3 結論

本試驗通過乙酸乙酯超聲提取、旋蒸濃縮、甲醇反提凈化對肉制品進行前處理，進而結合高效液相色譜儀—熒光檢測器測定肉制品中3,4-苯并(α)芘殘留量，結果表明：3種濃度添加水平樣品（5，50，500 ng）經乙酸乙酯超聲提取兩次、旋蒸濃縮、甲醇反提凈化后，回收率分別為87.4%，88.1%，87.6%，精確度分別為2.37%，2.06%，1.83%，方法檢出限為0.15μg/kg。本方法可行性大，穩定性和準確性好，與文獻[6]、[15]的方法相比具有更穩定、更準確，操作簡單、低污染、低成本等優勢，符合環境友好型檢測要求，適合肉制品中3,4-苯并(α)芘殘留量檢測。

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