NaCl和PEG6000脅迫下棗組培苗中ZjAPX的表達

孟玉平 ，曹秋芬 ，2，，郭慧娜 ，，任 瑩 ，王國平

（1.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031；2.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，山西太原030031；3.山西大學生物工程學院，山西太原030006；4.山西省農業科學院果樹研究所，山西太谷030815）

為了從分子水平了解棗樹適應性強、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄的特性，為農作物的抗性育種提供優良的功能基因，近年來山西省農業科學院生物技術研究中心果樹生物技術課題組構建了棗樹結果枝（落性枝）的cDNA文庫[1]，并對獲得的一些與抗逆性有關的功能基因進行了深入的研究。ZjAPX（DDBJ/EMBL/GenBank的注冊號為AB608053）是其中獲得的一個棗樹抗壞血酸氧化酶基因，對其進行了原核表達蛋白的研究[2]和cDNA序列生物信息學分析及完整開放閱讀框植物表達載體 PEZR（K）-LNY-ZjAPX的構建[3]。大量的研究表明，抗壞血酸過氧化物酶基因（APX）的表達受各種環境脅迫因子（如干旱、高鹽、除草劑、低溫、病原菌侵染）的誘導[4-6]。

本研究以棗樹組織培養苗為供試材料，探討了在不同濃度的NaCl和PEG6000模擬干旱脅迫條件下ZjAPX基因的表達，以了解棗樹ZjAPX在逆境脅迫時的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用的NaCl，PEG6000及MS培養基中所用試劑均購自天津天大化工；植物激素6-BA和 NAA，PEG6000，飽和酚，DEPC，RNA提取所用到的試劑均購自生工生物工程（上海）有限公司；DL 2000Marker購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒（ PrimeScriptRRTMaster Mix），熒光定量PCR試劑盒（SYBQRPremix EX TaqTMⅡ），熒光定量過程中所用的PCR管均購自大連TaKaRa（寶生物）工程有限公司；用于PCR鑒定和熒光定量的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；熒光定量PCR儀為Applied Biosystems的 7300Real Time PCR System。

植物材料采用組織培養的棗樹苗（Ziziphus jujuba Mill）。 繼代培養基為：MS＋6-BA 0.5mg/L＋瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0；生根培養基為：1/2 MS＋NAA 0.3mg/L＋肌醇50mg/L＋瓊脂6 g/L，pH值 5.8～6.0。培養室溫度為（25±1）℃，光照周期12 h/d，光照強度2 000～3 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 棗苗脅迫處理 選取生長30～40 d健壯且長勢較一致的生根棗苗植株用于脅迫處理。將植株放入加有NaCl和PEG6000的液體生根培養基中，單株處理，重復3次，以植株放入不加NaCl和PEG6000的液體生根培養基為對照。

PEG6000滲透壓處理分別為 0.5，1.2MPa，處理后分別于 1，4，7，24，48 h取樣。NaCl濃度處理分別為 50，300mmol/L，處理后分別于 3，6，24，48 h取樣。所取樣品立即冷凍于液氮后保存于-70℃冰箱，用于RNA的提取。

1.2.2 RNA提取和質量檢測 采用CTAB法[7]提取1.2.1處理樣品的總RNA，用DNaseⅠ除去DNA。用蛋白核酸分光光度計檢測總RNA的OD和A260/A280值，甲醛變性凝膠電泳觀察總RNA條帶的完整性。

1.2.3 反轉錄 利用反轉錄試劑盒將1.2.2提取的總RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系：5×Prime ScriptRBuffer4μL，TotalRNA 1μg，總體積15μL；反應條件：37℃ 15min，85℃ 5 s。 反轉錄后測定OD值，并稀釋成為100 ng/μL作為模板cDNA用于熒光定量分析。

用Real-time PCR相對定量的方法分析棗植株在不同脅迫條件下ZjAPX mRNA的相對表達量。內參基因選用棗樹組蛋白ZjH3基因[8-9]（GenBank：EU916201），根據其序列設計特異性引物。 上游引物 H1：5′-GAGGAAGCAACTGGCAAC TAAGG-3′；下游引物 H2：5′-ACCAGCCTCTGGA ATGGAAGTTTG-3′，可擴增出 165 bp的片段。目的基因ZjAPX的上游引物X1：5′-TCGATATCGC TGTCAGACTAC-3′；下游引物 X2：5′-TTGTCCTC TCTTCCTGGATG-3′，可擴增出145 bp的片段。引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.4 熒光定量PCR 定量PCR反應體系總體積 20μL，包括上下游引物各 0.4μL（ 20 pmol/μL），cDNA1μL（100 ng），SYBRRPremix EX TaqTMⅡ10μL，ROX Reference Dye 0.4μL，ddH2O 7.8μL。反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸31 s，循環40次。基因相對定量表達分析 采 用 2-ΔΔCt法， 其 中，ΔΔCt＝ 處 理 棗 苗（ Ct（ZjAPX）值－Ct（Actin） 值）－對照棗苗（Ct（ZjAPX）值－Ct（Actin）值），每個樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 棗組培苗脅迫處理后形態學觀察

將正常生長且長勢較一致的棗組培苗進行NaCl和模擬干旱PEG6000處理，各處理短時間脅迫后植株外觀形態上沒有什么異常，當處理至24 h時，300mmol/LNaCl和 1.2MPa PEG6000溶液處理過的棗組培苗葉片開始出現萎蔫；處理至48 h時，300mmol/L NaCl處理的棗組培苗葉片變白，有死亡跡象，1.2MPa PEG6000溶液處理的組培苗葉片全部變白死亡。

2.2 RNA的質量檢測

用蛋白核酸分光光度計檢測所提取的總RNA，結果表明，其A260/A280值在1.8～2.0之間，甲醛變性凝膠電泳發現28S和18S的rRNA條帶完整，28S的rRNA條帶亮度為18S的rRNA條帶亮度的2倍，表明總RNA有較好的完整性和純度，能滿足反轉錄的要求。

2.3 PEG6000模擬干旱脅迫下ZjAPX的表達

由圖1可知，在不同滲透壓、不同時間的PEG6000處理棗組培苗后，ZjAPX的表達量不同。0.5MPa處理下，1 h時ZjAPX的表達量較低，為2.9，隨著脅迫時間的增加表達量也增高，7 h時增加到17.4，但24 h又降低到11.3，48 h時最高（24.8）；增加PEG6000的濃度使滲透壓達1.2 MPa時，處理1 h的ZjAPX表達量已增至9.9，4 h時最高（17.7），此后隨著時間的增加表達量降低，24 h稍有回升，48 h時植株已干枯死亡。整體趨勢表現為隨著干旱脅迫時間和滲透壓的增加，ZjAPX的表達量增高，在達到一定的量后開始降低，干枯死亡之前又有一個高峰。

2.4 NaCl脅迫下ZjAPX的表達

由圖2可知，低濃度50mmol/L的NaCl脅迫下，3～48 h的ZjAPX的表達量一直在增加；高濃度 300mmol/L的 NaCl脅迫時，3～24 h的ZjAPX表達量在增加，24 h時最高（29.4），48 h時葉片表現出死亡跡象，ZjAPX的相對表達量降低到22.6。整體表現為隨著NaCl脅迫時間和濃度的增加，ZjAPX的表達量增高，當達到一定量時表達量開始降低，直至植株死亡。

3 討論與結論

干旱、鹽堿、低溫以及高溫等多種逆境將會破壞植物活性氧解毒系統，使活性氧累積損傷細胞膜。增強植物體內活性氧清除酶類的活性及抗氧化代謝的水平是提高植物抗逆性的重要途徑之一。Gueta-Dahan等[10]通過比較耐鹽和鹽敏感柑橘中抗氧化酶的活性發現，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的活性在二者之間差別不大，而耐鹽柑橘中的抗壞血酸過氧化物酶活性大大高于鹽敏感柑橘。Tsugane等[11]也發現，與野生型擬南芥相比，在鹽脅迫條件下能進行光合自養的擬南芥隱性突變體中，抗壞血酸過氧化物酶的活性顯著增強。馬長樂等[12]利用Northern雜交分析了鹽地堿蓬APX基因在400mmol/L NaCl脅迫下的表達，證明APX基因表達量增加，而且APX酶的活性也顯著增加，說明該基因受鹽誘導，推測APX可能在保護鹽地堿蓬免受氧化損傷的過程中起到了一定作用。大量研究證明，植物在逆境下會誘導抗壞血酸過氧化物酶基因表達[13-15]。

本研究利用組織培養植株生長環境和培養基均易控制的特點，探討了在其培養基中添加NaCl和PEG6000脅迫棗組培苗后ZjAPX基因的表達，結果表明，ZjAPX基因受NaCl和PEG6000誘導表達，而且在一定濃度和時間范圍內，隨著濃度的增大和脅迫時間的延長其表達量增高。說明ZjAPX基因參與了植株抵抗鹽和干旱帶來的傷害，但隨著脅迫傷害的增大，植物體的耐性減弱，ZjAPX基因的表達隨之降低。為了進一步證明ZjAPX基因在提高植物耐鹽、耐旱中的作用，將利用模式植物擬南芥繼續對ZjAPX基因的功能進行鑒定。

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