呼出氣體冷凝物中肺癌標志物采集裝置的改進和優化設計*

王 林，鄒瑩暢，張 希，王 鏑，趙 聰，王 平

(浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027)

有研究報道，目前癌癥已經成為人類最致命的疾病之一[1]。據統計，在2012年美國新增癌癥患者163萬人，超過57萬人死于癌癥[2]。根據中國腫瘤登記中心對腫瘤監測結果顯示，2012年中國新增癌癥患者312萬例，因癌癥死亡病例達270萬[3]。而肺癌是癌癥中發病率和致死率排前三的惡性腫瘤，早發現、早治療能夠增加肺癌的存活率。因此如何能夠快速、簡便地實現肺癌的篩查成為研究重點。

呼出氣體冷凝液EBC(Exhaled Breath Condensate)檢測具有無創、快速、收集簡單等優點[4－5]，并具有一定的穩定性[6]，近年來利用EBC進行疾病檢測的研究成為熱點。有研究表明EBC中含有氮氧化物、蛋白質、核酸等物質，這些標志物可直接和間接地反映肺癌等疾病[7－8]．然而EBC至今仍然沒有采集標準，ATS/ERS對EBC進行研究，建議在采集EBC時采用惰性材料，采集時間設置為10 min，并禁止唾液等的污染，同時ATS/ERS通過研究發現不同采集物質所需采集時間、溫度設置等并不相同，并建議在研究中根據研究物質、研究對象的不同進行適當的參數設置[9]。

董敬軍等[10]使用商品化EBC采集儀器Ecoscreen采集EBC，并檢測并分析CEA的含量從而研究了不同分期、不同癌癥類型EBC中CEA的水平，最終得出結論通過檢測EBC中CEA可以很好地區分非小細胞肺癌不同類型及分期。他們的研究為檢測EBC中CEA提供了很好的思路。我們在進行EBC中CEA采集時發現不同采集溫度和采集時間對EBC采集及檢測有很大的影響，而之前的研究中并未報道EBC采集CEA的最佳采集溫度、最佳采集時間等信息。

目前國際上通過呼出氣體冷凝物EBC中肺癌標志物(Biomarkers)進行肺癌和肺部疾病早期、無創和快速診斷[11]，是一個新的研究熱點。然而呼出氣體冷凝物國際上尚沒有統一的標準，且針對呼出氣體冷凝物中不同的標志物采集標準也不相同，因此，需要進一步的改進和規范化。目前國際上商業化的EBC采集儀器主要是德國耶格公司生產的Ecoscreen采集儀，但經過預實驗發現該儀器采集CEA時效率偏低，且受試者在使用該儀器進行EBC采集時會產生不適反應。基于上述問題，我們提出了EBC采集儀器改進設計方法。目前采集EBC中癌胚抗原(CEA)的研究中缺乏最佳的采集條件，如最佳采集溫度、最佳采集時間等，這些都可能導致EBC中CEA測量不準確。基于以上問題我們對EBC采集裝置進行改進設計。

1 EBC采集裝置改進設計

EBC是通過冷凝呼出氣體水蒸汽而獲得，因此EBC采集裝置中包含吹嘴、EBC收集器、冷凝裝置等部分。不同的設計者在設計EBC采集裝置時使用不同的方法，耶格公司生產的Ecoscreen是一款商業化EBC采集裝置，Ecoscreen的EBC采集器主要包含以下部分:吹嘴、唾液收集器、長管及EBC收集器，如圖1所示。

Ecoscreen使用了咬合式吹嘴，使得受試者能夠很好地適應吹氣過程，吹嘴后的唾液收集器能夠很好地將唾液收集，從而很好地避免唾液受到污染。使用長管結構能夠在一定程度上消除呼吸死腔的干擾，這些都是Ecoscreen的優勢。目前有學者使用Ecoscreen采集EBC中的PH、H2O2、小分子有機物等物質并取得很好的效果。然而根據ATS/ERS的建議，EBC收集裝置吹嘴與EBC收集器之間應盡量減小阻力，這樣可以保證氣路的通暢并收集更多的物質。目前，Ecoscreen儀器的主要不足是吹嘴與EBC收集器之間的距離太長，導致收集的過程中EBC中部分水蒸汽冷凝在長管中，另外，由于病人在使用Ecoscreen時會吸入收集管內的冰冷氣體，這導致很多受試者產生不適的反應。

圖1 商業化儀器Ecoscreen EBC采集裝置示意圖

針對Ecoscreen儀器的不足，在我們的改進設計中，使用了短管連接吹嘴與EBC收集器以減少吹氣的阻力，同時設計了單向閥，包含吸入單向閥和呼出單向閥以保證受試者沒有重復吸入呼出的氣體，如圖2所示。單向閥的存在還可以讓受試者呼吸EBC收集管外的氣體，使用這樣的設計可以增加受試者的舒適度。

圖2 我們設計的EBC采集裝置示意圖

2 EBC的臨床采集實驗

采用我們設計的EBC收集裝置放置在溫度可調的冷凝儀器中，保證采集過程溫度保持不變。所有受試者要求禁食禁煙12 h，于晨起空腹時進行EBC采集。所有受試者在25℃的室溫環境下進行平靜呼吸。所有受試者要求戴鼻夾，采集EBC所有通氣通過口腔進行。對所有收集的EBC檢測唾液淀粉酶也排除唾液的污染。EBC采集完畢在1 h內使用雅培公司Architect i2000 System進行癌胚抗原(CEA)檢測，該儀器使用化學發光法對CEA進行檢測，檢測下限為0．5 ng/mL．

2．1 最佳采集溫度的確定

有研究表明EBC收集量與采集溫度有相關性，采集溫度越低則EBC收集量越大。然而采集溫度越低會加大采集成本，在使用干冰制冷的情況下甚至會在采集器中產生冰塊從而影響采集的持續性。另外，EBC中CEA濃度與采集溫度是否相關尚無研究報道。為研究采集量、CEA濃度與采集溫度的關系，采用圖2所示EBC收集裝置收集10個肺癌病人呼出氣體冷凝液，分別在 0℃、－5℃、－10℃、－15℃的溫度設置中采集EBC，每個病人收集時間為5 min，收集結束后檢測收集量及CEA的含量，結果如表1所示。

表1 不同溫度條件下EBC收集量(±s，mL)及CEA濃度(±s，ng/mL)

表1 不同溫度條件下EBC收集量(±s，mL)及CEA濃度(±s，ng/mL)

采集溫度/℃ 收集量/mL CEA濃度/(ng·mL－1)0 0．5±0．2 3．0±2．1－5 0．7±0．5 3．7±2．8－10 1．1±0．6 4．2±3．4－15 1．2±0．7 4．1±3．6

2．2 最佳采集時間的確定

EBC采集時間越長則采集量越多，然而采集時間加長會導致受試者產生不適反應，如口干、胸悶、心慌、頭暈等不良反應。另外，EBC中CEA濃度與采集時間是否有相關性尚無研究。為明確EBC采集量、EBC中CEA濃度與采集時間之間的關系，采用圖1所示采集裝置對10名肺癌患者進行EBC采集，分別采集5 min、10 min、15 min，并檢測收集量及CEA濃度，結果如表2所示。

表2 不同采集時間EBC收集量ˉ±s，mL)及CEA濃度ˉ±s，ng/mL)

表2 不同采集時間EBC收集量ˉ±s，mL)及CEA濃度ˉ±s，ng/mL)

采集時間/min 收集量/mL CEA濃度/(ng·mL－1)5 1．1±0．6 4．2±3．4 10 1．8±1．2 4．5±3．6 15 2．4±1．4 4．4±3．9

其中，采集時間為5 min時10個受試者均未出現不適反應，采集時間為10 min時有兩個受試者出現口干，采集時間為15 min時7個受試者出現口干，5個受試者出現頭暈。

2．3 與Ecoscreen儀器的比較分析

本研究對10名受試者進行EBC采集，采集對象分別使用自制的EBC收集器以及耶格公司生產的Ecoscreen進行EBC采集，采集溫度為－10℃，采集時間為5 min，結果如表3所示。

表3 EBC收集量ˉ±s，mL)及CEA濃度ˉ±s，ng/mL)對比

表3 EBC收集量ˉ±s，mL)及CEA濃度ˉ±s，ng/mL)對比

采集裝置 收集量/mL CEA濃度/(ng·mL－1)我們研制的EBC收集器 1．1±0．6 4．2±3．4 Ecoscreen 儀器 0．6±0．6 1．6±0．9

3 采集肺癌病人及健康人EBC

使用我們研制的EBC采集裝置針對65例肺癌患者樣本及56例體檢健康者進行EBC采集，并將采集后的樣本進行CEA檢測。肺癌組及健康對照組在年齡、性別、吸煙情況均無統計學差異。其中肺癌組均經病理證實為肺癌，健康對照組通過體檢確認未得惡性腫瘤，各組均排除嚴重的肝腎功能不全及血液系統疾病。

使用SPSS11．0軟件對肺癌病人及健康人EBC中CEA檢測數據進行處理，使用ROC曲線分析EBC中CEA濃度水平，并獲取陽性閾值，并計算EBC中CEA檢測靈敏度及特異性。

3．1 肺癌組與健康對照組EBC中CEA水平

比較肺癌組與健康對照組EBC中CEA檢測值，如表4所示，最終 p＜0．01，說明兩組間有顯著差別。

表4 肺癌組與健康對照組EBC中CEA水平(±s，ng/mL)

表4 肺癌組與健康對照組EBC中CEA水平(±s，ng/mL)

分組 人數 EBC中CEA檢測值肺癌組 65 3．9±3．3健康對照組 56 1．9±1．7

3．2 ROC 曲線

ROC曲線(ReceiverOperatingCharacteristic curve，受試者工作特征曲線)是以不同的閾值計算敏感度和特異性的曲線。以“敏感度”為縱坐標，“1－特異性”為橫坐標，畫出EBC中CEA檢測水平的ROC曲線，如圖3所示。根據ROC曲線，綜合考慮敏感性與特異性指標，定出EBC中CEA陽性指標值為2．55 ng/mL，此時敏感性為49．2%，特異性為83．9%。

圖3 肺癌患者及健康對照組EBC中CEA水平的ROC曲線

4 分析與討論

EBC是通過對人體呼出氣體進行冷凝而獲得的呼出氣體冷凝物，其中水蒸汽冷凝而成的液態水是主要成分，約占99%[12]。有研究表明，在人體呼出氣的水蒸汽中僅有少部分水滴含有非揮發性有機分子，這些有機分子包裹在水蒸汽的這些小水滴中，包括脂溶性物質和水溶性物質[13]，因此如何將這些水滴有效冷凝成為EBC采集的關鍵。

作為一種最新發展起來的技術，EBC具有無創、安全、重復性好等優點，但是目前EBC并沒有特定的采集標準。不同的研究者在研究不同的物質時EBC采集方法并不相同，甚至在收集同樣的物質也會有不同的采集方法[14]。ATS/ERS據此指出EBC采集應針對采集的物質、采集對象等進行采集條件探索，并就EBC采集材料、采集溫度、唾液收集器、保存等提出一些建議[9]。本研究在進行EBC檢測時充分考慮并采用了這些建議。

在采集溫度的研究中，0℃、－5℃、－10℃條件下EBC采集量及CEA濃度呈增加的趨勢，顯示隨著溫度的降低EBC采集量增加，同時CEA濃度也有所增加，這說明溫度為0℃、－5℃時呼出氣體中的水蒸汽并未完全冷凝為液態水進入收集器中。溫度為－10℃、－15℃時EBC采集量及CEA濃度相差不大，無統計學意義，說明在溫度達到足夠低的程度時采集量與CEA濃度已經近乎達到飽和，這時呼出氣體中水蒸汽近乎全部轉化為液態水進入收集器中。考慮到溫度過低會加大采集成本，并可能造成受試者的不適等因素，而在－10℃時采集量及CEA濃度已經接近峰值，說明－10℃是采集EBC中CEA的最佳采集溫度。

在采集時間的研究中，采集 5min、10 min、15 min的條件下EBC采集量呈遞增趨勢，而CEA濃度則相差不大(p＜0．05，說明差異沒有統計學意義)，說明采集時間長短對CEA濃度并無影響。考慮到運用檢測儀器Architect i 2000自動進樣系統進行CEA檢測的最低樣本量為0．5 mL，而5 min采集時間內10個受試者采集量為0．5 mL～2 mL，樣本量可以滿足儀器檢測的需求，因此5 min是采集EBC中CEA的最佳采集時間。

通過裝置的改進及最佳采集條件的設置對肺癌組和健康對照組進行EBC采集，并對CEA進行檢測，結果發現肺癌組EBC中CEA濃度為(3．9±3．3)ng/mL，而健康對照組為(1．9±1．7)ng/mL，兩組差異有統計學意義，說明EBC中CEA能夠區分肺癌組和健康對照組。通過ROC曲線確定EBC中CEA的陽性閾值為2.55 ng/mL，此時敏感性為49．2%，特異性為83．9%，說明通過本裝置進行的EBC中CEA采集分析可以很好地檢測出肺癌中EBC的標志物。

我們接下來的工作是設計SAW傳感器(Surface Acoustic Wave Sensor，聲表面波傳感器)進行CEA的檢測，如圖4所示。SAW傳感器通過壓電效應進行能量傳遞，傳播路徑上質量的變化能夠導致輸出頻率的改變，由于SAW傳感器的這種特性導致其得到廣泛的研究和應用[15－16]。SAW傳感器通過體聲波進行傳導，振蕩頻率可以達到500 MHz，因此具有很高的靈敏度。在SAW傳感器上植被CEA抗體，通過微流控控制芯片將EBC導入敏感區，此時CEA將與CEA抗體結合，引起敏感區表面質量變化，從而導致波傳導屬性發生變化，通過檢測輸出叉指電極的頻率變化可以檢測CEA濃度。我們將在后面的論文中進行報道。

圖4 檢測EBC中CEA的SAW傳感器芯片原理示意及封裝圖

5 結論

本研究設計了一種新型的呼出氣體EBC中肺癌標志物的采集裝置，并通過臨床實驗確定了該采集裝置的最佳采集時間、最佳采集溫度等參數。與國際上采用的商業儀器Ecoscreen進行了對比實驗，結果表明，本裝置在5 min內能夠收集到更多的EBC，且CEA的濃度要高于Ecoscreen，說明本裝置比Ecoscreen更適合采集EBC中的CEA。將采集儀器設置在最佳采集時間和采集溫度下，采集肺癌病人及健康對照組EBC，并對CEA進行檢測，發現肺癌組EBC中CEA濃度明顯高于健康對照組。通過ROC曲線獲得EBC中CEA檢測的陽性閾值，并由此獲得EBC中CEA檢測肺癌的靈敏度和特異性。最終結果表明，本研究設計的EBC采集裝置能夠更好地檢測EBC中CEA，具有更高的靈敏度和特異性。

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