Ki67、Survivin在早期宮頸癌中的表達與預后相關性分析

[摘要] 目的 探討Ki67、Survivin在早期宮頸癌組織中的表達，且與術(shù)后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系；分析Ki67和Survivin的相關性。 方法 收集110例手術(shù)切除或活檢標本，包括正常宮頸組織，宮頸癌組織（按5年存活率及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組），進行免疫組織化學法檢測Ki67、Survivin蛋白的表達。 結(jié)果 宮頸癌組織中Ki67的表達率為85%，明顯高于正常宮頸組織，Ki67陽性表達與術(shù)后生存時間呈負相關（x2=5.7624，P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關（x2=11.4820，P<0.01）；宮頸癌組織中Survivin表達率為80%，高于正常宮頸組織，Survivin陽性表達與術(shù)后生存時間呈負相關（x2=5.2410，P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關（x2=10.0624，P<0.01）。 結(jié)論 Ki67、Survivin可作為反映宮頸癌預后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的指標。

[關鍵詞] 宮頸癌；Ki67；Survivin；生存時間；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；免疫組織化學

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）07-20-04

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，目前全球發(fā)病的年輕化趨勢越來越明顯，嚴重威脅女性健康。隨著分子生物學的發(fā)展，人們還發(fā)現(xiàn)了越來越多的與預后相關的生物學指標[1]，如凋亡途徑相關基因，細胞增殖相關基因，腫瘤轉(zhuǎn)移相關的基因以及與生存相關的基因等。反映腫瘤細胞增殖活性的指標很多，目前以Ki67最具代表性；近年來該因子用于各種惡性腫瘤生物學行為的研究Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，有研究表明Survivin的表達與腫瘤的惡性程度、預后不良呈正向關系，是一個有潛在價值的腫瘤標志，與腫瘤預后密切相關。本實驗通過收集標本，通過免疫組織化學法檢測Ki67、Survivin蛋白在宮頸癌組織中的表達，分析兩者在宮頸癌組織中的表達情況，進一步探討其與宮頸癌預后的關系及兩者之間的相關性，為臨床防治宮頸癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

宮頸標本取自2000年1月～2010年12月就診于山西省長治市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科且行手術(shù)切除的宮頸癌患者，選取80例為實驗組，其標本均經(jīng)病理檢查確診為早期宮頸癌的宮頸新鮮備用標本，其中存活率>5年有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組10例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組30例，存活率<5年有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組10例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組30例，患者年齡21～66歲，平均（45.2±14.3）歲。所有患者術(shù)前均未接受過放射治療、化學治療。正常對照組：隨機選擇同期在該院因子宮肌瘤等行子宮全切術(shù)經(jīng)病理證實宮頸正常的宮頸標本30例。

1.2 主要試劑

鼠抗人Ki67單克隆抗體（即用型），兔抗人Survivin單克隆抗體（即用型），EDTA抗原修復液，SP免疫組化染色超敏試劑盒，DAB顯色劑，Ki-67、Survivin即用型S-P試劑盒，均有武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 試驗方法

對所收集的正常宮頸組織、早期宮頸癌組織蠟塊作常規(guī)HE染色，采用SP法，嚴格按照購買試劑的說明書進行操作，每個染色流程均設有對照以作為染色質(zhì)量控制標準。具體步驟如下：（1）切片：水溫在40℃左右，4 μm貼于硅化的載玻片上。（2）烤片：60℃烤箱3 h以上。（3）脫蠟：常溫下3缸，二甲苯酸缸10 min依次過。（4）水化：由高濃度的酒精到低濃度酒精（95%酒精2 min→95%酒精2 min→70%酒精1 min→蒸餾水1 min→蒸餾水1 min）。（5）修復、洗修復液：將修復液放入高壓鍋內(nèi)，加熱至沸騰后，將石蠟切片放入鍋內(nèi)，不加閥開始噴氣計時5 min，關閉氣閥加壓10 min后，壓力鍋用冷水沖洗冷卻后，取出石蠟切片，用蒸餾水洗。（6）畫線：用專筆在組織周圍畫線。（7）上機：切片待畫線的線干后上架（PBS預洗→次→3%H2O2 10 min→PBS沖洗1次→一抗孵育60 min→PBS沖洗1次→二抗孵育15 min→PBS沖洗2次→DAB顯色4 min→蒸餾水沖洗2次）。（8）DAB顯色：取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌，顯色時間主要取決于切片組織背景和陽性，控制背景顏色不宜太深，用水洗滌。（9）Mayor 蘇木素（#AR0005）輕度復染30 s左右，蒸餾水浸泡數(shù)分鐘后浸入飽和Na2HPO4溶液中2 min，取出后洗滌干燥。（10）干燥后的片子，第2天取出后用中性樹膠（#AR1018）封片，顯微鏡觀察。

1.4 結(jié)果判斷

Ki67染色以細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，根據(jù)陽性細胞所占比例分為：陽性細胞數(shù)<10%為陰性表達，≥10%為陽性表達；Survivin陽性染色主要位于胞漿和（或）胞核，以細胞漿和（或）細胞核出現(xiàn)黃色顆粒為陽性信號，采用雙盲法根據(jù)光鏡下隨機觀察切片5個視野，用半定量積分法判斷結(jié)果，陽性細胞所占百分比為0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。顯色強度黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕褐色為3分。細胞染色強度（等于陽性細胞積分、顯色強度積分）：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用x2檢驗及Fisher's精確概率法，兩指標間比較采用二元變量的等級相關檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織Ki67的表達

Ki67在宮頸癌組的陽性表達率明顯高于正常宮頸組，在正常宮頸組的陽性表達率為6.7%，宮頸癌組為85%，兩組Ki67的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 不同宮頸組織Survivin的表達

Survivin在宮頸癌組的陽性表達率高于正常宮頸組，兩組Survivin的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 宮頸癌組織中Ki67與Survivin的表達與預后生存時間及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系

在80例早期宮頸癌組織中存活率>5年的40例標本中Ki67的陽性表達率為75%，Survivin的陽性表達率為70%；而存活率<5年的40例標本中Ki67的陽性表達率為95%，Survivin的陽性表達率為90%。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標本20例，Ki67陽性表達率為95%，Survivin陽性表達率為90%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標本60例，Ki67陽性表達率為82%，Survivin陽性表達率為77%。研究結(jié)果顯示，Ki67、Survivin的表達均與宮頸癌預后生存時間及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 宮頸癌組織中Ki67和Survivin表達之間的相關性

在68例Ki67陽性的宮頸組織標本中，有20例Survivin表達陽性，陽性率為29.41%，在12例Ki67陰性的宮頸癌組織標本中，有5例Survivin表達陰性，7例Survivin表達陽性，陽性率為58.33%。兩者的表達是不相關的（r=0.182，P=0.258）。見表3。

3 討論

宮頸癌是全球發(fā)病率居第2位的婦女惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，在我國居女性惡性腫瘤之首，且有逐年遞增的趨勢。山西省襄垣縣、陽城縣是國內(nèi)外罕見的宮頸癌高發(fā)區(qū)，且發(fā)病人群有年輕化的趨勢，是嚴重威脅婦女健康的疾病之一。研究[2]發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌5年存活率為85.3%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年存活率為70.07%；導師前期研究[3-5]發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的5年存活率為87.4%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年存活率為49.7%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的5年存活率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。隨著分子生物學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了越來越多的與預后相關的生物學指標，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因的表達、調(diào)控，細胞凋亡以及細胞增殖有關。

3.1 宮頸癌與Ki67

反映腫瘤細胞增殖活性的指標很多，目前以核增殖抗原Ki67最具代表性；國內(nèi)外文獻報道[6]多種惡性腫瘤中均存在Ki67的過度表達。因此推測Ki67可能是一種癌基因[7]，過度表達可以導致腫瘤的發(fā)生；Ki67與惡性腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移和預后密切相關，已廣泛用于研究腫瘤的生物學行為及預后分析。Ki67抗原[8]屬于非組蛋白，是一種與細胞增殖相關的核抗原，因產(chǎn)生抗體的克隆生長在培養(yǎng)板67而得名。Ki67僅分布于細胞核內(nèi)[9]，高度增殖的細胞多與癌前病變組織及其惡性組織相關，增生、增殖常被認為是生長紊亂的早期指標。已有國內(nèi)外文獻報道[10]，Ki67可作為許多腫瘤的預后指標，另有研究表明Ki67在早期宮頸癌進展中有較強的預測作用。本研究通過收集早期宮頸癌蠟塊標本，以正常宮頸組織切片為對照，采用免疫組織化學法對Ki67進行測定，探討Ki67與宮頸癌預后生存時間及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系，進一步證實Ki67表達與宮頸癌預后的相關性。

3.2 宮頸癌與Survivin

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，可以通過3種途徑[11]抑制細胞調(diào)亡：（1）通過內(nèi)源性和外源性途徑抑制細胞調(diào)亡；（2）參與細胞有絲分裂的調(diào)節(jié)和胞質(zhì)分裂；（3）促進血管的形成。Survivin在癌組織中過度表達克服凋亡檢測點，通過有絲分裂促進轉(zhuǎn)化細胞的異常增殖；在大多數(shù)人類常見腫瘤如肺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，前列腺癌，乳腺癌，胃癌等中表達異常升高；其表達往往與腫瘤的惡性程度、預后不良呈正向關系，是一個有潛在價值的腫瘤標志，與腫瘤預后密切相關。Kim等[12]對不同宮頸組織中Survivin的表達的研究發(fā)現(xiàn)，其在Ⅰ級CIN中的表達率為66.7%，在Ⅱ～Ⅲ級CIN中表達率為87.5%，在宮頸鱗狀上皮癌組織中表達率為100%。研究認為，Survivin的表達與宮頸癌的發(fā)展密切相關。Yoshida 等[13]研究顯示Survivin表達上調(diào)預示生存期短和預后不良。而Lee等[14]研究卻顯示Survivin的表達和生存率之間無關聯(lián)性。Survivin是否可以成為宮頸癌的一個新的預測指標尚有爭議[15-16]。本試驗通過收集標本，利用SP法對早期宮頸癌組織標本及正常宮頸組織標本Survivin的測定，分析其與預后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系，進一步探討及證實Survivin高表達與早期宮頸癌預后的相關性，并得出結(jié)論。

本課題立足山西省這一宮頸癌高發(fā)區(qū)，首先對2000年1月～2010年12月就診于長治市醫(yī)院的早期宮頸癌患者進行流行病學調(diào)查，分析其生存時間。在此基礎上聯(lián)合檢測Ki67與Survivin基因，其分別在早期宮頸癌組織中高表達，驗證了Ki67、Survivin基因在早期宮頸癌中的表達情況，以及均與宮頸癌患者術(shù)后生存時間呈負相關、與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關。同時分析Ki67、Survivin兩種蛋白表達在早期宮頸癌中的相關性差異無統(tǒng)計學意義，兩者無明顯相關性，通過聯(lián)合檢測Ki67和Survivin表達與宮頸癌發(fā)生的相關性，進一步發(fā)現(xiàn)兩種基因聯(lián)合與宮頸癌臨床病理特征、術(shù)后生存的關系，有望為術(shù)后有效評估患者預后，指導術(shù)后輔助干預提供理論依據(jù)，也為下一步進行二者表達與宮頸癌發(fā)病機制的研究及尋求新的治療宮頸癌靶點提供理論依據(jù)[17-18]。

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